编者按：本期特邀兰州大学循证医学研究中心田金徽教授团队，基于网络药理学探索热毒宁注射液治疗新冠肺炎（COVID-19）的作用机制。结果显示：热毒宁注射液可能通过其有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李碱和金圣草（黄）素等作用于炎性细胞因子、丝裂原活化蛋白激酶等靶点调控AGE-RAGE､Human cytomegalovirus infection､TNF和IL-17等通路发挥治疗新冠肺炎的作用。

田金徽教授，男，博士研究生导师，兰州大学教授，第九届甘肃青年科技奖、甘肃省高校青年教师成才奖和兰州大学隆基教学新秀奖，担任11个国家级和5个省级学会委员。2011年11月和2018年11月赴University of East Anglia分别学习网状Meta分析和IPD Meta分析，以第一或通讯作者发表SCI论文30余篇。其团队主要致力于循证医学方法学研究、医学文献与数据挖掘和循证医学/护理证据转化与利用的研究，当前主要针对国内外新冠肺炎防控研究进行持续报道。

《中国医药导刊》2020年第3期“新冠肺炎防治”专栏速览

热毒宁注射液治疗新冠肺炎的有效成分和机制初探

高亚， 刘明， 杨珂璐， 施树珍， 刘依嘉， 孙炜， 田金徽

       新型冠状病毒肺炎（以下简称“新冠肺炎”，corona virus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒感染导致的一种急性肺炎，具有传播速度快、传染性强的特点^[1]。新型冠状病毒可通过飞沫、接触和粪口等途径传播，人群普遍易感，老年人及有基础疾病者感染后病情较重^[1,2]。轻症患者主要表现为出现发热、咳嗽、乏力等症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸衰竭、休克，甚至死亡^[3-5]。目前尚无治疗COVID-19的特效药，临床上主要采用中西医结合的方式对症治疗，并表现出良好的效果^[6,7]。热毒宁注射液由青蒿、金银花和栀子3味药组成，具有清热解毒、疏风散热等作用，主要用于上呼吸道感染、急性支气管炎和外感风热所致的高热、微恶风寒、头身痛、咳嗽、痰黄等症^[8,9]。现代药理学研究表明热毒宁注射液具有解热镇痛、抗病毒、抗菌、抗炎等多种作用^[8-10]，临床上也常用于治疗肺炎^[11]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》^[12]推荐热毒宁注射液治疗重型和危重型COVID-19。但热毒宁注射液治疗COVID-19的机制目前尚不清楚。本研究旨在通过网络药理学筛选出热毒宁注射液治疗COVID-19的作用靶点和信号通路，阐述其作用机制，为进一步的研究提供参考。

1  方法

1.1  热毒宁注射液有效成分和作用靶点的获取

　　利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以热毒宁注射液中3味中药“青蒿”“金银花”“栀子”为检索词进行检索，以药动学特性中的口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和类药性（drug-likeness， DL）≥0.18为标准进行筛选，获得热毒宁注射液的有效成分。并从TCMSP数据库中下载这些有效成分的靶点。

1.2  COVID-19靶点的预测和中药活性成分-靶点网络构建

　　以“novel coronavirus pneumonia”为关键词检索GeneCards数据库和OMIM数据库获取COVID-19相关靶点。将药物有效成分的靶点与疾病靶点取交集，以获取热毒宁注射液治疗COVID-19的潜在作用靶点。使用R软件生成“药物-化合物-靶点”的药理网络文本，将文本录入到Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，构建热毒宁注射液的药理网络。

1.3  蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

　　将热毒宁注射液治疗COVID-19的潜在作用靶点导入到STRING数据库中，获得PPI网络。并将得到的PPI网络信息导入Cytoscape 3.7.2 软件，通过cytoHubba功能分析网络的拓扑参数。

1.4 GO（gene ontology）功能富集与KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）生物通路富集分析

　　为了探索热毒宁注射液治疗COVID-19潜在靶点的功能和在通路中的作用，本研究利用Bioconductor生物信息软件包（http：//www. bioconductor. org/），借助R软件以P<0.05和q<0.05为标准进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，并生成主要作用靶点的生物学过程（biological process， BP）、细胞组成（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）柱状图和KEGG 信号通路气泡图。然后利用Cytoscape 3.7.2 软件构建靶点-信号通路网络图，进一步探索靶点和信号通路在热毒宁注射液治疗COVID-19 中的作用。

2  结果

2.1  热毒宁注射液中的有效化合物筛选结果

　　通过TCMSP数据库进行检索，利用参数OB≥30%，DL≥0.18进行筛选，共获得有效化合物60个，其中青蒿22个，金银花23个，栀子15个。MOL000006-luteolin为青蒿和金银花共有化合物，MOL000358-beta-sitosterol、MOL001494-Mandenol和MOL003095-5-hydroxy-7-methoxy-2-(3，4，5-trimethoxyphenyl)chromone为金银花和栀子共有化合物，MOL000098-quercetin、MOL000422-kaempferol和MOL000449-Stigmasterol为青蒿、金银花和栀子共有化合物。经过去重后，共获得热毒宁注射液有效化合物50个，见表1。

表1  热毒宁注射液中的有效化合物

2.2  热毒宁注射液与COVID-19的共同靶点

　　以“novel coronavirus pneumonia”为关键词，在GeneCards和OMIM数据库共获得COVID-19相关靶点259个。将热毒宁注射液有效化合物的208个靶点和COVID-19潜在靶点进行映射取交集共获得共同靶点44个（见图1），即热毒宁注射液治疗COVID-19的潜在靶点，详细靶点信息见表2。

图1  热毒宁注射液和COVID-19靶点韦恩图

表2  热毒宁注射液和COVID-19共同的靶点

2.3  热毒宁注射液有效化合物-靶点网络分析

　　根据筛选出的热毒宁注射液活性成分和作用于COVID-19的潜在靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件构建有效化合物-靶点网络（见图2），图中绿色节点代表青蒿所含的有效化合物，水红色节点代表金银花所含的有效化合物，黄色节点代表栀子所含的有效化合物，红色节点代表不同药物共同的有效化合物，蓝色节点代表作用靶点。网络中共有77个节点（其中33个为有效化合物节点，44个为靶点节点）和181条边。平均每个化合物连接1.33个靶点，每个靶点连接4.11个化合物，说明热毒宁注射液通过多成分-多靶点发挥治疗作用。通过网络拓扑学分析发现，中心度值和度值排名前五位的化合物为槲皮素（quercetin， MOL000098）、山柰酚（kaempferol， MOL000422）、木犀草素（luteolin， MOL000006）、异鼠李碱（isorhamnetin， MOL000354)和金圣草（黄）素（chryseriol， MOL003044)。

图2  热毒宁注射液有效化合物-靶点网络

2.4  PPI网络与关键靶点

　　将44个热毒宁注射液治疗COVID-19的潜在靶点输入到STRING数据库，构建PPI网络（见图3）。该网络图有44个靶点，494条相互作用关系，各节点平均度值为22.5。将PPI网络信息导入Cytoscape 7.2.1中，运用cytoHubba对度值进行排序，发现度值前五位的靶点依次为IL6、CASP3、MAPK8、ALB和MAPK1。

图3  热毒宁注射液治疗COVID-19潜在靶点的PPI网络图

2.5  GO富集分析与KEGG通路分析结果

　　使用R软件的Bioconductor生物信息软件包，以P<0.05和q< 0.05为标准进行GO富集分析，得到BP条目1356个，CC条目25个，MF条目87个。分别对各类别前20个条目进行可视化分析，生成柱状图（见图4、图5、图6），图中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数，颜色越红则富集越明显。图4显示在生物过程中主要富集条目为脂多糖应答（response to lipopolysaccharide， 20/44）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin， 20/44)和对凋亡信号通路的调节（regulation of apoptotic signaling pathway， 18/44）等。图5显示在细胞组成方面主要富集条目为膜筏（membrane raft， 9/44）、膜微区（membrane microdomain， 9/44）、膜区（membrane region， 9/44）等。图6显示在分子功能方面主要富集条目为细胞因子受体结合（cytokine receptor binding， 13/44）、细胞因子活性（cytokine activity， 10/44）、受体配体活性（receptor ligand activity， 10/44）等。

　　对44个共同靶点进行KEGG富集分析，得到150条通路。对前20个通路生成的气泡图（见图7），图中纵坐标表示富集通路的名称，横坐标表示基因的百分比，气泡越大则富集基因数量越多，颜色越红则富集越显著。共同靶点主要富集于甲型流感（Influenza A）、麻疹（Measles）、乙型肝炎（Hepatitis B）、结核（Tuberculosis）、百日咳（Pertussis）等疾病和AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus infection、TNF、IL-17等通路上。

图4  热毒宁注射液主要作用靶点BP柱状图

图5  热毒宁注射液主要作用靶点CC柱状图

图6  热毒宁注射液主要作用靶点MF柱状图

图7  热毒宁注射液主要作用靶点KEGG富集分析气泡图

2.6  靶点-通路图结果

　　将得到的通路和靶点信息导入到Cytoscape 3.7.2软件，构建靶点-通路图（见图8）。图中水红色六边形代表通路，绿色正方形代表靶点，形状越大代表富集越显著。主要的核心靶基因包括RELA、MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL6、CASP8、CASP3、IL1B和STAT1。

注：红色代表通路；绿色代表靶点

图8  热毒宁注射液作用靶点-通路图

3  讨论

　　本研究使用TCMSP 数据库对热毒宁注射液的中药活性成分进行筛选，运用GeneCards和OMIM数据库对COVID-19靶点进行预测筛选，通过构建有效化合物-靶点网络发现热毒宁注射液具有33个有效化合物，对应44个靶点，可见热毒宁注射液是通过“多成分-多靶点”的特点对COVID-19发挥治疗作用。研究发现中心度值和度值排名前五位的化合物为槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李碱和金圣草（黄）素。槲皮素是最具代表性的黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、保护心血管和预防退化性疾病等作用^[13-15]。山萘酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节和预防心血管疾病等多种药理活性^[16]。研究表明山柰酚能够显著性抑制血清中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β等水平， 从而发挥抗炎作用^[17,18]。木犀草素体外抑制流感病毒的活性较强^[19]，并且可以通过下调TNF-α、IL-1、IL-6 等的表达，增加内源性抗病毒基因^[20]。此外，木犀草素还具有抗炎、抗氧化、抗菌和免疫调节等作用^[21]。异鼠李碱可通过抑制NF-κB信号传导和调节促炎因子的产生发挥抗炎作用，还可通过阻止活性氧的产生发挥抗氧化作用，并具有内皮保护、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗心肌纤维化、抗血小板凝集和抗肿瘤等作用^[22-25]。金圣草（黄）素具有抗氧化，抗炎，抗肿瘤，抗骨质疏松和心脏保护的特性^[26]。可见热毒宁注射液中主要有效化合物具有抗病毒、抗炎和调节免疫力的作用，可用于治疗COVID-19。金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、清肺排毒汤和痰热清注射液同为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》^[12]中推荐的治疗COVID-19的中药注射液或汤药。网络药理学研究表明这些药物的主要有效成分均包括槲皮素、山奈酚和木犀草素^[6,20,27-30]，可见对COVID-19有治疗作用的中药具有相似的主要活性成分。

　　通过筛选发现RELA、MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL6、CASP8、CASP3、IL1B和STAT1是热毒宁注射液治疗COVID-19的主要靶点。RELA是NF-κB的家族成员之一，在严谨反应环境中，RELA基因编码的RELA蛋白使GDP或GTP磷酸化生成四或五磷酸鸟苷，可影响致病菌的侵染力、细胞毒力和生物膜形成^[31,32]。MAPK1、MAPK14、MAPK8同属于MAKP（丝裂原活化蛋白激酶）家族，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，在细胞的生长、分化、应激适应、炎症反应等多种细胞生理/病理过程中起重要作用^[33]。IL6和IL1B属于白细胞介素家族，具有传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及参与炎症反应的作用^[34]。白介素IL-6缺乏可导致对病毒、寄生虫和细菌感染的先天和适应性免疫受损^[35]。CASP3和CASP8是细胞凋亡中起重要调节作用的蛋白酶，CASP8可参与启动细胞凋亡，CASP3可参与细胞凋亡的效应^[36]。此外，研究表明它们还可参与调节炎症反应^[37,38]。STAT1与炎症反应密切相关，抑制STAT1表达能降低气道平滑肌细胞中趋化因子的释放，减轻气道炎症反应^[39]。

　　通过GO富集分析发现，热毒宁注射液靶点在生物过程中主要涉及脂多糖应答、对细菌来源分子的反应、对凋亡信号通路的调节和对生物刺激的细胞反应等。这与许冬玉等^[20]对清肺排毒汤的GO生物过程富集结果一致，说明热毒宁注射液治疗COVID-19过程中可能和清肺排毒汤具有相似的生物功能。KEGG信号通路富集结果涉及AGE-RAGE、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus infection、TNF和IL-17等通路。其中最主要的信号通路是AGE-RAGE通路，参与AGE-RAGE信号通路的基因有BCL2、CASP3、MAPK14、BAX、PRKCA、RELA、MAPK8、STAT1、ICAM1、MAPK1、CDK4、IL6、IL1B、CCL2、PRKCB、NOS3、SERPINE1和IL1A。该通路可激活核转录因子-κB（NF-κB）通路，引起多种黏附因子、趋化因子、生长因子、炎症因子的释放，最终引起慢性细胞活化和组织损伤^[40,41]。此外，卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染和人巨细胞病毒感染为病毒感染的过程，TNF信号通路和IL-17信号通路是炎症反应中的作用通路[42]。故推断热毒宁注射液可能通过调节病毒、炎症反应和免疫功能等过程发挥治疗COVID-19的作用。

4  结论

　　综上所述，热毒宁注射液可能通过其有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李碱和金圣草（黄）素等作用于炎性细胞因子、丝裂原活化蛋白激酶等靶点调控AGE-RAGE、Human cytomegalovirus infection、TNF和IL-17等通路发挥治疗COVID-19的作用。但本研究仅为网络药理学的初步预测，确切的作用机制仍需通过进一步的实验验证。

参考文献略

　　本文刊登于《中国医药导刊》2020年3期，更多精彩内容可登陆《中国医药导刊》官方网址http://www.zgyydk.cn，热忱欢迎相关研究人员积极投稿。