由于SARS-CoV-2的全球大流行，近十年来在减轻全球结核病负担方面取得的成就，逐渐被削弱。及时确诊和适当的治疗是巩固全球消除结核病成果的关键。因此了解和阻断传播链，同时对每位患者实施适当的治疗十分重要。在全球基因测序技术快速发展的大背景下，全基因组测序（WGS）已成为应对这两个挑战的解决方案选择之一。目前，部分卫生系统选择依靠WGS进行药物敏感性测试和实施个体化治疗。

Illumina测序平台经常用于公共卫生实验室，是结核病WGS的一个参考标准。该平台的碱基测序准确性较高，使得这项技术成为基因型耐药性预测和监测的一个有吸引力的工具。

近日，英国牛津大学研究团队将Nanopore测序性能与Illumina平台进行了比较，并对其准确性进行了评估，以证明其用于患者护理和公共卫生系统的可靠性。该研究结果发表在Lancet Microbe上，文章题为“Evaluation of Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility testing and outbreak investigation: a genomic analysis”。

文章发表在Lancet Microbe 

该研究目标是确定纳米孔是否可以作为现有illumina测序方案的替代品，包括UKHSA使用的COMPASS。研究团队试图匹配自研方法，并将其应用于连续过滤器中，如图1所示。最后一组过滤器对7个验证分离株的中位SNP检测精确度为99.3%（IQR为99.1~99.6），SACR（召回率）为90.2%（88.1~94.2）。相比之下，使用COMPASS处理的Illumina测序数据中位精确度为99.6%（99.4~99.7），SACR为91.9%（87.6~98.6）。

图1. Illumina COMPASS流程和Nanopore BCFtools流程中SNP的召回率和精确度。

将这些过滤器应用于所有151个分离株后，Illumina COMPASS流程测得所有分离株之间的SNP距离和Nanopore的BCFtools流程测得数据显著相关（R2=0.988, p<0.0001）。图2显示了20个Illumina测得SNP所在分离株之间的距离相关性。值得注意的是，在距离阈值为12时，只有两对分离物（红点）没有被Nanopore连接。

图2. Illumina（COMPASS）和Nanopore（BCFtools）数据的成对SNP距离关系。

在这些阈值处，研究团队发现通过Illumina测序聚集在一起的分离株可与Nanopore测序结果聚集在一起，但在阈值12处，Nanopore测序从群集9中漏掉了一个分离株（图3）。在阈值12处，簇7和簇8合并，Nanopore测序认为两个分离株的距离为12，Illumina测序距离为14。Nanopore测序将簇9中的一个分离株视为单例；断开连接的Illumina测序距离为12，Nanopore测序距离为15。

只有一个Illumina测序单例被Nanopore测序连接到一个预先存在的簇（簇2）上，Illumina测序的阈值为5，Nanopore测序的阈值为6，SACR值为1.000，这意味着Nanopore测序不会从正确的聚类中漏掉任何分离株。当这两种技术的阈值为12时，SACR为0.965，只有一个分离株从正确的聚类中漏掉。

图3. Illumina测序和Nanopore测序传输聚类的一致性。

研究团队利用不同范围的Nanopore和Illumina测序比率生成了1000个模拟数据集，并分析了对SACR、精确度（SACP）和超额聚类率（XCR）的影响（图4）。

随着Nanopore测序数据比例的增加，SACR是一致的。在12 SNP距离阈值处，SACR在3:1的Nanopore:Illumina测序比例下从1.0降低到最小值（中值）0.928；SACP平稳地从1.0下降到与纯Nanopore数据集相似的值，阈值为12的中位数为0.899；XCR逐渐降低到纯纳米孔水平。

图4. 模拟不同比例的Nanopore和Illumina基因组数据的数据集。

最后，研究团队分析了WGS预测与基于培养的药物敏感性测试的一致性（图 5）。与预期一致，研究发现Nanopore和Illumina测序的结果几乎相同。Nanopore 比Illumina（阿米卡星和链霉素）少两次漏诊耐药（假阴性）。与 Illumina（异烟肼）相比，Nanopore数据导致了一个额外的假抗药性（假阳性）。此外，研究团队发现随着Nanopore测序深度的增加，预测精确度没有明显提高。

图5. 根据Illumina和Nanopore全基因组测序数据，Mykrobe正确预测的耐药和敏感表型数量。

综上所述，该研究比较了现有的Illumina技术和新兴的Nanopore技术在预测耐药性和使用SNP识别假定传播簇能力方面的表现。分析表明，使用Nanopore数据，研究团队获得的中位数精确度为99.3%，召回率为90.2%，表明使用当前的Nanopore测序数据，可以在结核分枝杆菌中获得高精度的SNP，同时召回率仅略有下降。

参考文献:

Michael B Hall,  Marie Sylvianne Rabodoarivelo,  Anastasia Koch. et al. Evaluation of Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility testing and outbreak investigation: a genomic analysis. Dec 19, 2022. DOI: 10.1016/S2666-5247(22)00301-9

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