CRISPR基因编辑系统自问世以来，已经成为用来研究细胞功能的强大工具。它在我们对癌症生物学的理解方面产生重大影响，并且在不断驱动新的发现，加快癌症诊断和治疗手段的开发。近日，Nature Reviews Cancer上的一篇综述盘点了CRISPR系统在癌症研究、诊断和治疗方面的最新进展。今日这篇文章里，药明康德内容团队将与读者分享这篇综述的精彩内容，点击文末“阅读全文/Read more”，即可访问综述原文网址。

CRISPR对癌症生物学研究的影响

癌症的精准医疗策略依靠发现促进癌症生长的基因突变，CRISPR基因编辑技术能够快速和有效地产生基因敲除，调节内源基因表达和复制与癌症相关的基因组变化。由于CRISPR技术的简便和高效性，目前生成基因敲除小鼠模型已经成为常规操作。而且，通过将CRISPR基因编辑系统的所有组分选择性地引入某些体细胞中，可以生成组织特异性的癌症模型。比如，使用CRISPR在造血干细胞中编辑Tet2，Runx1，Dnmt3a，Nf1和Smc3基因可以激发急性髓系白血病。将CRISPR递送到肝脏、胰腺或肺部能够迅速生成具有复杂表型的癌症模型。

▲利用CRISPR技术生成不同类型的癌症模型（图片来源：参考资料[1]）

综述作者指出，CRISPR技术对癌症研究产生的最大影响可能是CRISPR筛选。这种筛选使用靶向基因组中不同基因的指导RNA（gRNA）文库，可以系统性地敲除细胞系或类器官中的任何基因，然后观察基因敲除对癌细胞生长或药物反应的影响。

CRISPR在癌症研究方面的另一个重要应用是追踪癌细胞的谱系变化。癌症的一大特征是它的异质性，癌细胞不断积累基因变异，导致产生具有不同特征的细胞克隆。理解肿瘤内部的异质性并且追踪新克隆的产生和演化让科学家们更全面地了解肿瘤发生。

目前，研究人员已经开发出多种基于CRISPR的追踪策略，能够在包含多种细胞克隆的混合细胞群体中，发现不同的细胞克隆，并且追踪它们随着时间推移的动态变化。CRISPR技术可以在细胞中引入独特的条形码，它们可用来标记癌细胞谱系。而最新的CRISPR记录系统能够在特定时间在基因组中引入标记，通过分析这些不同的标记，可以构建不同癌细胞克隆之间的谱系关系。

▲用于追踪癌细胞克隆谱系的不同CRISPR策略（图片来源：参考资料[1]）

CRISPR在癌症诊断开发方面的应用

尽早发现癌症给治愈癌症提供最好的机会，CRISPR技术可以帮助开发出更为灵敏的分子诊断工具，辅助癌症的早期检测。基于Cas12和Cas13的CRISPR分子诊断系统已经被用于从患者肿瘤组织活检中发现与癌症相关的基因突变。它们在发现特定致癌基因突变序列后可以通过切割携带荧光报告蛋白的RNA序列，发出荧光信号。这一技术在新冠大流行期间被用于生产快速灵敏的新冠病毒检测。同样的平台可用于生成高度灵敏的个体化癌症发现和监控系统。

此外，CRISPR系统可用于在基因组的特定区域精准切下DNA片段，与传统的随机基因组片段化（fragmentation）手段相比，这种方式可以富集感兴趣的DNA片段，与下一代基因测序相结合，可以在样本量非常少的情况下，发现特定基因上的基因突变。这一技术目前正在临床试验中接受评估，用于发现卵巢癌中的p53突变。

CRISPR在癌症治疗方面的应用

在癌症治疗方面，CRISPR技术的主要应用之一是工程化改造免疫细胞，生成抗癌免疫疗法。多个研究团队已经显示，使用CRISPR基因编辑靶向敲除T细胞的PD-1表达可以提高T细胞的抗癌活性。这类候选疗法已经进入临床试验阶段。

此外，在生产同种异体的“通用型”CAR-T细胞疗法时，CRISPR基因编辑可以用于敲除内源性T细胞受体和来自健康供体的T细胞表面的人类白细胞抗原（HLA），从而降低异体细胞输入带来的免疫排斥和移植物抗宿主病风险。

而且，使用CRISPR/Cas9技术还可以将表达CAR的序列特异性地插入到细胞的T细胞受体α恒定区（TRAC）的基因位点，带来CAR的一致性表达。在体外和小鼠模型中，这种方法生成的CAR-T细胞与常规CAR-T细胞相比，表现出增强的抗癌活性。

▲CRISPR工程化改造T细胞的多种方式（图片来源：参考资料[1]）

在体外改造T细胞疗法之外，使用CRISPR基因编辑直接靶向驱动癌症的基因变异是一个吸引人，同时也非常困难的挑战。理论上，通过CRISPR基因编辑直接纠正驱动癌症的基因变异，或者杀死产生特定基因变异的癌细胞，可以达到抑制肿瘤生长的效果。然而，这一策略需要克服多重障碍，包括完成肿瘤特异性疗法递送，以及需要达到高效率的基因编辑。

目前的临床前研究已经发现一些肿瘤特异性基因编辑的策略。比如，靶向致癌基因融合的CRISPR基因编辑系统可以在选择性靶向肿瘤细胞的同时，扰乱促进肿瘤生长的基因变异。另一项临床前研究让CRISPR-Cas13a系统的转录受到NF-κB转录因子的控制，由于NF-κB在多种癌症中被过度激活，这一策略可以在癌细胞中特异性表达CRISPR-Cas13a系统，敲低致癌基因的表达，达到抑制癌细胞生长的效果。

▲利用NF-κB控制CRISPR-Cas13a系统的表达，肿瘤特异性降解致癌基因（图片来源：参考资料[4]）

在递送技术方面，脂质纳米颗粒（LNP）在递送新冠mRNA病毒方面已经获得巨大的成功。利用LNP递送编码Cas9的mRNA和gRNA在概念验证研究中已经有效靶向有丝分裂必需的基因PLK1，在胶质母细胞瘤的小鼠模型中达到70%的体内基因编辑效率，造成细胞凋亡并且抑制肿瘤生长50%，改善生存期30%。在LNP表面偶联靶向肿瘤特异性抗原的抗体也成功驱动分散的肿瘤选择性吸取LNP，提高肿瘤特异性编辑效率。

整体来看，这些临床前研究显示了体内CRISPR基因编辑在治疗癌症方面的潜力，不过将CRISPR体内基因编辑转化为可行的临床期抗癌疗法仍然需要很多努力。

局限和前景

虽然CRISPR在癌症生物学领域有广泛的用途，然而综述作者指出，这一技术的进一步开发，特别是在临床治疗方面，仍然需要克服几个局限性。Cas酶导致的DNA双链断裂可能引发无意的DNA片段丢失，在有些情况下可能驱动染色体碎裂（chromothripsis），从而影响正常细胞的功能。CRISPR技术导致的DNA双链断裂损伤可能刺激p53信号通路，导致细胞死亡或者筛选p53功能下降的细胞。此外，CRISPR系统的脱靶编辑可能性一直是研究人员关注的问题。

不过，虽然这些潜在局限性是推动CRISPR技术进一步发展的重要局限，目前科学家们已经开发出工具来发现和最小化这些事件的发生。作者表示，它们可能不会显著阻碍CRISPR技术在临床的应用。未来的5-10年里，CRISPR技术将真正步入临床期疗法的阶段，在CAR-T疗法和其它免疫细胞工程化方面的工作预示着它们将在治疗癌症方面具有有所作为。

在科学研究方面，CRISPR技术已经开始解决癌症的很多根本问题，通过描述单个基因在癌症细胞行为中的作用，它将为构建下一代免疫疗法、揭示非编码区域和调控元件在肿瘤发生中的作用等多个领域赋能。CRISPR技术在过去和未来都将是我们理解和治疗人类癌症的关键工具之一。

参考资料：

[1] Katti et al., (2022). CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer, https://doi.org/10.1038/s41568-022-00441-w

[2] Zhang et al., (2022). Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Molecular Cancer, https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6

[3] Gong et al., (2022). CRISPR/Cas-Based In Vitro Diagnostic Platforms for Cancer Biomarker Detection. Analytical Chemistry, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c02533

[4] Gao, et al., (2020). A new tool for CRISPR-Cas13a-based cancer gene therapy. Mol. Ther. Oncolytics, https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.09.004

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