2019年6月，ICH认可了ICH S12基因治疗产品的非临床生物分布考虑主题。2021年6月3日ICH批准了ICH S12的草案版本，预计最终定稿将于2023年6月颁布实施。S12是第一个针对基因治疗产品非临床开发的ICH指南，为非临床生物分布研究的设计优化提供了参考，促进基因治疗产品的非临床和临床开发。

1、简介

1.1. 目标

本指南旨在为基因治疗（GT）产品开发中的非临床生物分布（BD）研究提供统一建议。本文件为非临床BD评估的总体设计提供建议，以及提供BD数据的解释和应用考虑，用于支持非临床开发计划和临床试验设计。本指南中的建议旨在促进GT产品的开发，同时根据3R原则（减少/完善/替换）避免不必要的动物使用。

1.2. 背景

了解GT产品体内给药后的BD概况是非临床开发计划的一个重要内容。BD数据有助于解释和设计非临床药理学和毒理学研究，以支持目标人群的早期临床试验。尽管各国监管机构已发布了包含BD研究建议的指南，但本文件为非临床BD提供了统一的定义，并传达了评估GT产品BD的总体考虑因素。

1.3. 范围

本指南范围内的GT产品包括通过转移的遗传物质表达（转录或翻译）来调节其作用的产品，包括纯化核酸（例如质粒和RNA）、经基因修饰以表达转基因的微生物（例如病毒、细菌、真菌，包括编辑宿主基因组的产品）和体外转基因人类细胞。本指南还涵盖旨在体内改变宿主细胞基因组而无需特定转录或翻译（即通过非病毒方法传递核酸酶和向导RNA）的产品。虽然某些地区目前尚未考虑GT，但本指南中概述的原则也适用于未经转基因表达的溶瘤病毒。本指南不适用于预防性疫苗，也不包括未使用基于生物技术的制造工艺生产的化学合成寡核苷酸或其类似物。GT产品通过排泄物（粪便）、分泌物（尿液、唾液、鼻咽液等）或通过皮肤（脓疱、溃疡、伤口）释放到体外被称为“脱落”。GT产品非临床脱落情况的评估不在本指南的范围内。GT产品的基因组整合和种系整合评估也不在本指南的范围内。

2、非临床BD的定义

BD是GT产品在相关动物物种中的给药部位以及靶组织和非靶组织（包括生物流体，如血液、脑脊液、玻璃体液）中的体内分布、持续和清除。非临床BD研究需要使用分析方法来检测收集样本中的GT产品和被转移的遗传物质，并可以包括检测被转移的遗传物质的表达产物的方法。

3、非临床BD评估的时机

在非临床研发早期阶段获得的初步BD数据可能有助于后续药理学和毒理学研究的物种选择（见第4.3节）。此外，在评估和解释非临床药理学和毒理学发现时，应提供BD数据。非临床BD数据还可以为设计首次人体临床试验提供信息（见第6节），因此，在临床试验开始之前完成非临床BD评估很重要。

4、非临床BD研究设计

4.1.一般考虑

BD研究可以作为独立的BD研究或与非临床药理学和毒理学研究结合进行（见第5.3节）。因此，在本文件中，“BD研究”一词表示两种情况。在给药代表拟用临床产品的GT产品后，应在相关动物物种中进行非临床BD评估（见第4.3节，可能的替代方案见第4.2节）。重要的是，给药途径（ROA）应尽可能反映预期的临床ROA，并且所研究的剂量水平应充分描述BD概况（见第4.5节）。

验证BD评估的数据质量、完整性和可靠性非常重要。原则上，非临床BD研究可以不符合良好实验室规范（GLP）；然而，当BD评估作为符合GLP的毒理学研究的一部分进行时，所有生命参数和样品采集程序符合GLP很重要。

4.2. 供试品

非临床BD研究中使用的供试品应代表预期的临床GT产品，将制造工艺、重要产品特性（例如效价）和最终临床配方（见第5.7节）纳入考虑。某些情况下，由含不同治疗性转基因或表达标记基因的临床载体的GT产品生成的非临床BD数据可用于支持BD概况（见第5.8节），例如，有荧光标记蛋白表达盒的相同血清型和启动子的腺相关病毒载体。

【首个正式上市的mRNA疫苗Comirnaty（BNT162b2）就是用编码荧光素酶的modRNA在小鼠中评估遗传物质的生物分布，用[3H]标记的脂质在大鼠中研究LNP的生物分布。】

4.3. 动物种类或模型

BD评估应在允许遗传物质转移和表达的相关动物物种或模型中进行。选择因素可能包括组织趋性、基因转移效率以及靶组织和非靶组织/细胞中转基因表达的物种差异。如果使用有复制能力的载体，动物物种或模型必须允许载体复制。

物种、性别、年龄、生理条件（即健康动物或动物疾病模型）对BD的影响也很重要。此外，应考虑动物物种对给药载体和/或表达产物产生免疫反应的可能性（见第5.4节）。从评估基因转移效率的初步研究或分析方法中产生的BD数据可以帮助在后续研究中选择合适的动物物种进行全面BD评估。

4.4. 动物组别大小和性别

应在每个预定的采样时间点评估每种性别（如适用）的适当数量的动物，以生成支持全面BD评估的足够数据（见第4.6节）。关于动物数量的一般建议见注1。根据3R的原则，动物总数可以是几项研究的总和。应为每个时间点评估的动物数量以及使用多个研究的组合数据（如适用）提供理由。当仅评估一种性别时，还应提供理由。

注1：一般而言，建议每种性别/组/时间点至少评估5只啮齿动物或3只非啮齿动物；然而，为每种性别纳入相等数量可能并不重要。需要为这些决定提供理由。

4.5. 给药途径和剂量水平选择

GT产品的ROA会影响BD特征，包括转导的细胞类型和免疫反应。因此，在可行的情况下，应使用预期的临床ROA给药GT产品（见注2）。

注2：对于使用的每个给药装置，重要的是提供数据以验证给药GT产品在动物体内的体积和剂量水平。此信息可能会影响对BD结果的解释。如果计划在临床试验中使用新型给药装置，考虑从使用该装置或其等效物进行的药理学和/或毒理学研究中采集BD数据。

所给GT产品的选定剂量水平应提供BD概况的充分特征，以帮助解释药理学和毒理学评估。最高剂量水平应为毒理学研究中预期的最大剂量水平（通常受动物大小、ROA/解剖目标或GT产品浓度限制）。然而，如果有适当的理由，预期最大临床剂量水平也可以作为BD评估的最高剂量水平。

4.6. 样本采集

目标和非目标组织及生物流体的样本采集程序应设计为将污染可能性降至最低。必须遵循预先规定的流程，包括对从每只动物（溶媒对照组和给药GT产品组）获得的样品进行适当归档，以及记录样品采集顺序。样本采集时间点应反映给药GT产品后，目标和非目标组织/生物流体中GT产品水平达到峰值、稳态（即平台）和下降（如可行）的预期时间。如适用，可包括其他时间点，以更全面地捕获稳态期长度并估计持续性。如果适用，应考虑包括重复给药后的时间点，以便评估GT产品水平。

对于有复制能力的载体，样本采集时间点还应包括由于载体复制和随后的清除阶段而检测到的第二峰值水平。

采集的样本应包括以下组织/生物流体：血液、注射部位、性腺、肾上腺、脑、脊髓（颈、胸、腰）、肝、肾、肺、心脏和脾脏，并可根据其他考虑因素进行扩展，如载体类型/趋性、表达产物、ROA、疾病病理生理学以及动物性别和年龄。例如，其他组织/生物流体可包括外周神经、背根神经节、脑脊液、玻璃体液、引流淋巴结、骨髓，和/或眼睛和视神经。关于最终采集样本应以对GT产品、目标临床人群和现有非临床数据的了解为指导。

如果预计不会出现全身暴露（例如，视网膜下给药）或给药部位没有泄漏，则可以提供选择特定组织/生物流体的理由。

还可以分析收集的样本是否存在表达产物。第5.2节提供了有关该评估的考虑因素。

5、具体注意事项

5.1. 分析方法学

对BD概况的评估需要量化组织/生物流体中GT产品的遗传物质（DNA/RNA）的数量，如果合适，还需要量化表达产物。目前，实时定量聚合酶链反应（qPCR）被认为是测量组织/生物流体中特定DNA（或者，通过反转录步骤，RNA）的“金标准”。核酸序列的量化对于评估GT产品中遗传物质的相对数量以及确定其累积或衰减的动力学非常重要。应建立并记录定量方法的灵敏度和再现性限值。作为分析开发的一部分，应进行加标和回收实验，以证明在不同组织/生物流体中检测目标序列的能力。其他技术可用于非临床研究以监测载体和/或表达产物的BD，包括但不限于：酶联免疫吸附试验（ELISA）；免疫组织化学（IHC）；蛋白印迹；原位杂交（ISH）；数字PCR；流式细胞术（FCM）；各种体内外成像技术；以及其他不断发展的技术。重要的是提供方法的全面描述和所用技术的理由，包括方法的性能参数。

【qPCR检测特定DNA的灵敏度最高，但目前缺少基于qPCR方法的生物分析相关指导原则】

5.2. 测量表达产物

虽然GT产品遗传物质的量化是主要的BD评估（见第5.1节），但确定不同组织/生物流体中表达产物的水平有助于描述给药GT产品后的安全性和活性特征。有关进行此类评估的决定应基于GT产品所需的非临床BD分析的程度，用基于风险的方法确定。该方法可包括考虑GT产品水平和组织/生物流体中的持续性；目标临床人群；以及与载体和/或表达产物相关的潜在安全问题。

5.3. 作为药理学和毒理学研究组成部分的非临床BD评估

除了独立研究外，BD评估也可以作为非临床药理学和毒理学研究的一部分进行。在这种情况下，BD评估应遵循第4节中规定的建议。如果在单个研究中无法满足某些建议（例如，每组动物数量或从每只动物收集预先确定的组织/生物流体），则应从多个研究中获得BD数据（见第4.4节）。

5.4. 免疫原性

动物，尤其是非人灵长类动物和其他非啮齿类动物对GT载体预存的免疫力可能会影响BD。在进行非临床研究之前，应考虑对可能存在的载体免疫进行筛查。理想情况下，首选经适当测试确定预存免疫力呈阴性的动物，但可能并不总是可行的。在这种情况下，重要的是将这一考量纳入用于将动物随机分组的无偏方法中。

某些情况下，由于表达产物的物种特异性，动物可能对表达产物产生细胞介导或体液免疫反应。给药GT产品后，也可能发生对载体的细胞介导免疫反应。这可能导致BD结果无法提供有用信息。如果预计会出现这种情况，申请人可以考虑收集和归档适当的样本，进行可能的免疫原性分析，以支持BD数据的解释。

不建议仅为了评估BD而对动物进行免疫抑制。然而，如果产品或物种特定的情况需要免疫抑制，则应提供理由。某些情况下，也可以考虑使用物种特异性替代转基因来规避免疫反应的影响。

5.5. 体外转基因细胞

体外转基因细胞（即体外转导/转染细胞，然后给动物/人类受试者使用）组成的GT产品的BD评估的注意事项包括细胞类型、ROA以及表达产物或基因修饰影响细胞在体内预期分布的可能性等因素（例如，细胞粘附分子的新表达或改变表达）。此外，动物发生移植物抗宿主病可能会使基因修饰人类T细胞的BD评估解释复杂化。一般来说，基于全身给药后预期的广泛分布，对造血来源的体外基因修饰细胞的BD评估不重要。如果预期分布到靶器官/组织，则应考虑BD评估。

【目前上市的6个CAR-T产品申报BLA所用的药代动力学试验】

5.6. 性腺组织中的BD评估

除非目标临床人群仅限于单一性别（例如，用于治疗前列腺癌），否则必须对两性性腺中的给药产品进行BD评估。如果载体或转移的遗传物质信号通过适当的分析方法不显示持续性（见第4.6节和第5.1节），则可能无需进一步评估。性腺中GT产品的持续存在可能导致进一步的研究，以确定动物生殖细胞（如卵母细胞、精子）中GT产品水平。这些数据以及其他因素（载体类型、复制能力、整合潜力、剂量水平、ROA等）可以告知意外生殖系整合的风险。有关此问题的更全面讨论，请参阅ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Inte- gration of Gene Therapy Vectors, Oct 2006。在非生殖系细胞（例如白细胞、支持细胞、睾丸间质细胞）中检测GT产品可以确保对受影响的非生殖系细胞的功能的额外考虑，尤其是当细胞类型对成功繁殖很重要时。

5.7. 其他非临床BD研究的触发因素

虽然GT产品的非临床BD评估是在首次人体临床试验之前确定的，但以下各种情况可能会导致进行额外的BD评估研究。

• 临床开发计划的重大变化，例如：ROA的变化；增加GT产品剂量水平，显著超过所测试的最大非临床剂量水平；给药方案的变化；纳入另一个包括两性的临床适应症，而不是最初提出的单一性别。额外的BD评估可纳入任何额外的药理学和/或毒理学研究。

• 载体结构或血清型的显著变化，以及可能导致趋性变化的任何其他修改。

• 可能影响最终GT产品配方（例如，添加可能改变载体趋性的辅料）或GT产品相关质量属性（例如，空衣壳比、体外基因转移活性、产品效价）的制造工艺变化。关于生产变更，需要考虑的其他因素包括载体粒度；聚集状态；抗原性；以及与其他宿主成分（如血清因子）的潜在相互作用。

5.8. 非临床BD研究可能不需要或不可行的情况

从使用相同GT产品进行的非临床研究中获得的现有BD数据支持不同的临床适应症，可能足以满足新的临床人群。然而，诸如剂量水平、给药方案、ROA和启动子的变化等考虑因素将纳入该决定。用先前表征的GT产品获得的BD数据，该GT产品具有相同的载体结构和决定其组织/细胞取向的其他特征，但转录/翻译产物不同，也可能支持豁免额外的非临床BD研究。应为这种方法提供理由。

某些情况下，不存在能够获知临床人群中BD概况的相关动物物种。例如，载体与人类细胞上的靶分子结合，但动物细胞上没有该靶分子时。在这种情况下，重要的是对问题和理由进行全面讨论，以支持评估非临床BD的替代方法。

6、非临床BD研究的应用

在动物中使用GT产品后的BD概况是非临床开发计划的关键组成部分。非临床BD数据有助于全面解释研究结果，以便更好地理解各种结果（期望的和不期望的）与使用GT产品的关系。将给药动物中观察到的结果归因于遗传物质（DNA/RNA）和/或表达产物，以确定潜在的益处：GT产品在人体给药前的风险状况。根据ROA、剂量水平、给药方案和动物免疫反应等因素，考虑BD数据与临床人群的相关性非常重要。这些数据还可以作为首次人体试验和后续临床试验的信息，例如给药程序（即受试者之间的给药间隔）、监测计划和长期随访评估。