Genome Biology ：中国科学院赖良学/王可品合作利用基因编辑技术实现猪条件性体内基因敲除和激活
时间：2023-01-25 15:02:07 热度：37.1℃ 作者：网络
基于CRISPR的工具极大增加了基因组和表观基因组编辑的难度。SpCas9是目前应用最广泛的核酸酶。然而，SpCas9递送困难且无法在体内调节其表达，这阻碍了其在大动物中的进一步应用。
2023年1月17日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学及王可品共同通讯在Genome Biology上在线发表题为“Doxycycline-dependent Cas9-expressing pig resources for conditional in vivo gene nullification and activation”的研究论文，该研究通过在Rosa26和Hipp11位点分别精确敲入二元四环素可诱导敲除元件构建了强力霉素诱导SpCas9表达( DIC )猪模型。利用该猪模型，可以很容易地实现体内和/或体外基因组和表观基因组编辑。
在DIC系统的基础上，通过组织特异性启动子控制rtTA元件的表达，设计了一种便捷的基于Cas9的条件性敲除策略，该策略允许在简单的化学诱导下一步生成生殖系遗传猪，从而实现基因功能的体内时空控制。为了验证DIC猪体内基因突变的可行性，进一步将含有TP53 - sg RNA、LKB1 - sg RNA和突变型人KRAS基因的AAV6载体递送到成年胰腺中，建立了原发性和转移性胰腺导管腺癌。总之，这些结果表明DIC猪资源将为条件体内基因组和表观基因组修饰的基础和应用研究提供有力的工具。
猪不仅是为人类提供食物的重要家畜，而且在免疫系统、解剖学、生理学、器官大小和新陈代谢等方面与人类有许多相似之处，是生物医学研究的理想模型。尽管基因编辑(GE) 猪模型并不像啮齿类动物模型那样具有普适性，但迄今为止，已经产生了越来越多对农产品、异种移植和人类疾病模型至关重要的基因编辑猪。
目前，GE猪主要通过胚胎显微注射定制的核酸内切酶元件或在体细胞中进行基因编辑后再进行体细胞核移植(SCNT)克隆来生产，这两种方法都非常费力、低效和耗时。具体来说，直接胚胎显微注射法不能保证基因型的一致性，需要长时间的杂交程序才能获得具有理想基因型的动物，并且很难通过同源定向修复( HDR )实现精确的基因敲入。或者，通过SCNT方法可以实现统一的基因型或精确的敲入。然而，由于HDR的低效率难以多次敲入。因此，获得多重精准基因编辑的GE猪品系，特别是由广泛使用的多重精准敲入Cre - loxP系统组成的时空限制性基因修饰仍然存在挑战。
为了解决上述问题，可以将Cas9和sg RNA的表达载体导入成年小鼠的特定组织进行直接的体内基因组编辑。然而，该方法由慢病毒或腺相关病毒( AAV )介导，由于Sp Cas9基因的大片段(~4.2 kb )导致编辑效率低下。为了克服这一问题，一种将Cre依赖的Cas9表达盒特异性插入Rosa26位点的小鼠模型应运而生。随后，在特定的体细胞类型中引入靶向目的基因的Cre和sg RNA，以方便高效地进行体内基因组编辑，从而避免了产生新的生殖系修饰的原始细胞系的要求。特别是应用于猪等大型动物，可以缩短生产时间，节约成本，是一种理想的替代方案。
最近，组成型表达Cas9的动物模型的产生，如Rosa26 - Cas9转基因猪，极大减少了病毒载体的有效载荷大小和所需递送的组分数量，从而促进了体内基因编辑技术的发展，但仍然无法实现SpCas9蛋白在体内的时间或空间可控表达。此外，不可控的Cas9表达引起的基因组损伤、脱靶效应和免疫清除反应，将阻碍这种组成型Cas9表达系统在动物模型中的应用，这对于基于Cre重组酶系统的诱导型表达系统也是无法避免的，其中激活后存在可持续的组成型Cas9表达。此外，Cre -重组酶被证实对猪胚胎发育有负面影响，并且在哺乳动物基因组中具有潜在的假重组位点。
四环素诱导系统过表达( Tet-On )系统是最突出和被广泛接受的诱导型系统之一，在转基因小鼠模型中得到了最广泛的应用。Tet - On系统使用与四环素响应元件( TRE )结合的反向四环素反式激活因子( rtTA )蛋白，在多西环素( Dox )存在的情况下激活感兴趣的外源基因的转录。通过使用具有灵活时间调控特性的四环素诱导系统系统，Cas9表达可以在Dox诱导下反复开启或关闭。此外，化学诱导剂Dox比Cre -重组酶更容易进入并传递到目标位点。
利用DIC系统靶向激活猪内源基因转录的示意图（图源自Genome Biology ）
该研究通过在Rosa26和Hipp11位点分别精确敲入rtTA表达盒和TRE控制的SpCas9 - T2A - tdTomato表达盒的双元Tet - On元件，尝试在体外和体内通过简单的化学诱导方法建立一个Dox诱导的Cas9表达( DIC )猪模型，从而允许猪体内SpCas9活性的灵活时间控制。在该猪模型中，通过简单地将sg RNA或转录激活复合物结合修饰的死亡引导RNA递送到猪胎儿成纤维细胞( PFFs )和/或特定组织中，并经过Dox诱导，即可实现体外和/或体内的基因编辑和染色体工程以丧失功能和体外调控内源性靶基因以获得功能。
在携带TRE控制的SpCas9 - T2A - tdtomato等位基因的PFFs的基础上，插入2A - rtTA - polyA表达盒和U6 - sgRNA表达盒，替换组织特异性表达基因的终止密码子，可在化学诱导下一步产生种系遗传猪，实现体内基因功能的时空控制。考虑到与啮齿类动物相比，具有人类更亲密的免疫系统的大型动物在体内基因突变介导的癌症建模方面的显著优势，通过将TP53 - sg RNA、LKB1 - sg RNA和突变的人KRAS基因导入DIC猪的成年胰腺，并在Dox诱导下，建立了原发性和转移性胰腺导管腺癌( PDAC )猪模型。DIC猪模型克服了Cas9蛋白体内递送的挑战，避免了组成型Cas9表达的副作用，并消除了潜在的Cre介导的遗传毒性，这将为生物医学和农业应用提供一个强大而灵活的条件体内基因组和表观基因组编辑平台。
参考信息：
https://doi.org/10.1186/s13059-023-02851-x
