中枢神经系统（CNS）肿瘤是原发或继发于脑和脊髓的一组良恶性疾病，具有很强的异质性，可分为100多种不同的类型。明确诊断肿瘤的确切类型和亚型，对于制定合适的治疗计划至关重要，但目前脑肿瘤的分子诊断通常依赖于组织活检，这可能会带来麻醉或神经外科手术相关的诸多风险。此外，在初步诊断后，如需进一步评估肿瘤进展、复发或获得新的基因改变，只能通过重新活检来证明。

近年来，测序技术和DNA甲基化分析发展迅速，已成为评估不同肿瘤类型的有利工具。通过测序技术可识别肿瘤的诊断标志物或可靶向的改变，但由于部分肿瘤可能不具有特定的单核苷酸变异或基因融合的特征，因此仅依据测序很难对其进行可靠的预测。基于完整的DNA甲基化分析，能够评估基因组内的数千个CpG位点，从而获得肿瘤的多维特征；将这些特征与参考数据库进行比较，可确定样本与特定CNS肿瘤实体的最高相似性。

近日，德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心的研究人员及合作者在Clinical Chemistry上发表了题为“Classification of Brain Tumors by Nanopore Sequencing of Cell-Free DNA from Cerebrospinal Fluid”的文章。研究团队对来自脑肿瘤患者脑脊液（CSF）中的游离DNA（cfDNA）进行了纳米孔测序，并使用随机森林分类器分析了拷贝数变异（CNV）和整体DNA甲基化模式。结果显示，在45%的样本中检测到了循环肿瘤DNA（ctDNA）并成功对肿瘤进行了分类，包括疾病进展患者和无已知残留病变患者样本。在所有含有可检测肿瘤DNA的样本中，CNV分析成功率高于比甲基化分析，总检出率分别为88%和44%。综上，来自CSF样本的cfDNA纳米孔测序数据可能是脑肿瘤初步诊断的一种潜在方法，也是疾病监测的重要工具。

文章发表在Clinical Chemistry

对CNS肿瘤进行精确的分子诊断，通常需要通过手术获得肿瘤组织；事先了解肿瘤类型可能会改进手术策略并减少手术相关风险。目前，液体活检分析越来越受到关注，已广泛用于各种癌症，其分析物（例如循环CTC和cfDNA）已被纳入临床试验研究。对于CNS肿瘤而言，CSF仍是诊断和监测的首选；cfDNA是一种相对稳定的CSF分析物，可通过全基因组低覆盖测序重现肿瘤的拷贝数变化，并可作为微小残留病的预后标志物。

研究团队首先采用低覆盖度纳米孔测序，对来自脑肿瘤患者129个CSF样本中的cfDNA进行了分析，并使用随机森林分类器（NanoDx）分析了CNV和甲基化模式，这些样本来自99名患者，共涵盖22种肿瘤。其中，髓母细胞瘤数量较多（38%），其次是室管膜瘤和毛细胞星形细胞瘤。患者中位年龄为19.2岁，大多数患者是儿童或青少年。

图1. 样本队列和技术特征概述。

结果显示，有110个样本被成功分析，其中有50个样本（45%）通过CNV或甲基化分析检测到ctDNA，这些样本包括术前和术后早期样本以及术后>14天样本，通常伴有临床未知的残余肿瘤或疾病复发。在22%的样本中，仅由CNV分析检测到ctDNA；在18%的样本中，同时由CNV和甲基化分析检测到ctDNA；在5%的样本中，仅由甲基化分析检测到ctDNA。

当NanoDx评分为0.072、均匀流形近似和投影（UMAP）可视化中胶质母细胞瘤聚类清晰时，两种分析方法均对肿瘤样本进行了正确分类。此外，研究团队还通过CNV分析发现了一些肿瘤组织或CSF特有的诊断、预后改变，例如多层菊形团样胚胎性肿瘤（ETMR）中C19MC的扩增、后颅窝A组（PFA）室管膜瘤中chr1q的增益及chr6q的减少，这些都是重要的预后标志物。

图2. 术前和术后早期样本的拷贝数和甲基化分析。

接下来，研究团队对手术后采集的61个样本进行了分析（图3）。结果显示，50个样本（82%）完成纳米孔测序；在20个样本（32.8%）中，ctDNA可以通过至少一种方法被检测到。CNV分析显示，17个样本（27.9%）中存在ctDNA。甲基化分析仅在7个样本（11.5%）中实现了正确的肿瘤分类。

图3. 术后和整个病程样本的拷贝数和甲基化分析。

上述结果表明，在50/129个样本（39%）和50/110个技术上成功的样本（45%）中，可以通过至少一种分析方法检测到ctDNA（图4）。研究团队还将上述分析结果与肿瘤组织的临床诊断和分子分析（如有）进行了比较，发现大多数CNV特征与相应肿瘤组织的特征一致。

此外，在检测到ctDNA的样本中，只有5个样本含有可在显微镜下检测到的肿瘤细胞。最后，研究团队进行了纵向分析，发现了与肿瘤复发有关的CNV，这凸显了液体活检检测肿瘤生物学潜在相关变化的潜力。

图4. cfDNA测序CNV和甲基化分析总结。

综上所述，该概念验证研究表明，纳米孔测序是通过CSF液体活检诊断CNS肿瘤的有力工具，能够在不同肿瘤实体、疾病状态的良性及恶性脑肿瘤样本中检测到ctDNA。与潜在肿瘤细胞的显微镜检查相比，基于cfDNA的液体活检使严密和纵向的肿瘤监测成为可能，具有额外的临床价值。总之，用于诊断和监测脑肿瘤的脑脊液cfDNA纳米孔测序有望整合到常规临床流程中，帮助医生实现高效、准确的诊断，并减轻患者医疗负担。

参考文献：

Afflerbach AK, Rohrandt C, Brändl B, et al. Classification of Brain Tumors by Nanopore Sequencing of Cell-Free DNA from Cerebrospinal Fluid [published online ahead of print, 2023 Aug 25]. Clin Chem. 2023;hvad115. doi:10.1093/clinchem/hvad115

https://academic.oup.com/clinchem/advance-article-abstract/doi/10.1093/clinchem/hvad115/7251226?redirectedFrom=fulltext&login=false#no-access-messag