【研究背景】

基因编辑技术代表了基因工程的一个革命性突破，为研究不同的生命过程和各种疾病提供了一个平台。CRISPR-Cas系统已被广泛用作基因组编辑工具，其中基于CRISPR-dCas9的转录激活系统作为一种有前景的基因治疗方法，正被广泛用于疾病治疗研究等领域。然而，如何实现对CRISPR-dCas9转录激活系统的有效时空控制限制了其广泛应用。近日，西安交通大学王福团队在美国化学学会旗下期刊《ACS Nano》上发表题为“Toehold-Based CRISPR-dCas9 Transcriptional Activation Platform for Spatiotemporally Controllable Gene Therapy in Tumor and Diabetic Mouse Models”的研究。该研究提出了一个miRNA响应的CRISPR-dCas9转录激活（mCTA）系统。该系统能够对哺乳动物细胞中内源性miRNA做出特异性响应，通过调控Fluc、DTA、PDX-1等不同的功能基因从而实现深层组织成像、肿瘤治疗及调节糖尿病小鼠血糖稳态等功能，为实现CRISPR-dCas9的有效时空调控提供了新方案。

【主要内容】

该研究创新性地将可编程的Toehold开关与dCas9-VPR连接，构建出mCTA系统，希望通过miRNA调控dCas9-VPR的表达。当特异性miRNA存在时，dCas9-VPR顺利表达，进而激活整个基因调控系统。通过对下游基因的替换，实现深层组织成像、肿瘤治疗及调节糖尿病小鼠血糖稳态等不同功能。

研究团队首先对系统的可行性进行验证，证实了mCTA系统确实对目标miRNA有响应；然后对系统的质粒配比、浓度依赖性响应、特异性、对内源性miRNA的响应等都做了相关验证，实现了系统的全方位优化（图1）。

图1. mCTA系统的验证与优化

随后研究评估了该系统的深层组织成像能力。下游基因选择荧光素酶基因Fluc，通过水动力注射法将mCTA系统递送到小鼠肝脏，然后进行体内生物发光成像（图2A）。结果表明，Fluc仅在引入外源性miR-21和m₂₁CTA时在肝脏中显著表达（图2B，D），这表明miR-21激活了m₂₁CTA系统。为了进一步证实mCTA系统对内源性miRNA的应答能力，我们创建了m₁₂₂CTA系统。该系统由肝脏特异性miRNA-122控制。图像结果显示，由于内源性miR-122在肝脏中的特异性高表达，表现出稳健的发光信号。相比之下，m₉CTA组与对照7*TRE-Fluc组无显著差异（图2C，E），进一步证实了mCTA的深部组织成像能力。

图2. mCTA系统深层组织成像能力的验证

接下来研究人员评估了mCTA系统在肿瘤治疗中的能力（图3）。首先在4T1乳腺癌细胞中验证了mCTA系统通过调控DTA基因抑制细胞迁移的能力，然后通过瘤内注射mCTA系统在小鼠皮下瘤模型中评估该系统应用于肿瘤治疗的能力。结果显示，m₂₁CTA系统可以显著抑制肿瘤生长，这为 mCTA系统在肿瘤治疗中的应用提供了证据。

图3. m₂₁CTA系统在肿瘤治疗中的应用

最后研究人员将该系统应用于糖尿病小鼠的治疗（图4）。首先通过STZ造模糖尿病模型小鼠，通过免疫组化、血液生化指标等证实糖尿病小鼠的构建成功。然后通过水动力法将系统质粒递送至小鼠肝脏，并记录治疗过程中小鼠的血糖变化。用 m₁₂₂CTA系统处理的小鼠血糖指数明显下降，而用m₂₁CTA处理的对照小鼠的血糖没有出现类似的下降。这一观察结果表明mCTA系统具有通过调控PDX-1基因调节糖尿病小鼠血糖稳态的能力。

图4. m₁₂₂CTA系统在糖尿病小鼠模型中的治疗应用

【小结】

该研究开发了一种可编程的miRNA控制的CRISPR-dCas9系统，实现了时空可控的目的基因激活。通过调控不同的下游基因如DTA或PDX-1，在癌症和糖尿病等多种场景中显示其治疗功能。该研究提供了一种通用策略，可应用于其他CRISPR-Cas系统，将有助于促进疾病诊疗在基因调控水平的提升。该研究论文第一作者为课题组博士生胡冲和博士后施潇蕊，通讯作者为西安交通大学王福教授。本研究得到了国家自然科学基金、陕西省自然科学基金等项目资助。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.5c01078