异种移植(xenotransplantation)可能为全球器官短缺危机提供变革性解决方案。异种移植指不同种属(如人与猪、猪与狒狒)之间的移植。如术后不采用合适的免疫抑制措施，受者对异种移植物将不可避免地发生强烈的排斥反应。

异种移植主要面临三大问题：免疫排斥，生理不相容，将微生物传播给受体的风险。例如，猪作为潜在的器官供体，但是猪体内含有猪巨细胞病毒 pCMV、猪圆环病毒PCV1 2 3 、猪嗜淋巴疱疹病毒 pLHV1 2 3 、猪内源性逆转录病毒PERV-A B C等；而且特别注意的是不能通过选择阴性动物、接种疫苗、治疗、早期断奶、初乳剥夺、剖腹产或胚胎移植来完全消除；PCMV 是第一个在异种移植中被证实具有致病性的病毒，对更昔洛韦具有高度耐药性，不幸的是，目前还没有针对 PCMV 的疫苗；当器官被 PCMV 感染时，存活时间显著缩短（可能机制是基于凝血系统的破坏以及免疫系统的抑制和衰竭）；其实诡异的是pCMV病毒感染了猪体内的上皮细胞（分布于心、肺、肠、肾等器官）后体积可暴增至正常细胞的6倍，从而导致受染器官水肿胀大、出血或积液，最终坏死。捐赠者的基因组中携带猪内源性逆转录病毒 (PERV) 序列，这存在人畜共患风险，因为 PERV 会传播到培养的人类细胞并整合到人类基因组中。猪供体器官携带多种病毒，如猪内源性逆转录病毒 (PERV)，以及在去年年初首例接受猪心移植患者体内检测到的猪巨细胞病毒（PCMV），可能是该患者死因之一。

为了进行临床研究，必须设计出临床就绪的猪供体，并在非人类灵长类动物 (NHP) 模型中成功测试其异种移植物，以评估其安全性和有效性。

这项研究中，在尤卡坦小型猪品种上创建了人源化猪供体，并移植了缺乏三种聚糖的猪肾移植物，有或没有PERV敲除（逆转录病毒灭活（RI））（称为3KO.RI或3KO），或具有七个人类的3KO 将带有或不带有 RI 的转基因（分别称为 3KO.7TG.RI 或 3KO.7TG）器官移植进入食蟹猴（Macaca fascicularis）。

2023年10月11日，来自eGenesis的Wenning Qin和Michele E. Youd团队在Nature杂志上合作发表了一篇题为Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation 的文章，他们对尤卡坦半岛小型猪供体进行69次基因编辑，以实现3种糖类抗原的消除、猪内源性逆转录病毒失活和7个人类转基因过表达，将供体猪肾移植到NHP体内并与临床相关免疫抑制方案相结合，可支持NHP长期存活达758天，这一研究成果使人们离基因工程猪肾脏移植的临床试验更近了一步。

人源化猪供体

选择尤卡坦小型猪品种是因为它的器官大小与人体器官相当。 此外，还选择了 OO 血型的猪来消除 ABO 血型不相容的情况。这些猪共被CRISPR/Cas9进行69次基因编辑。 这些编辑破坏了三个聚糖合成基因（GGTA1、CMAH和B4GALNT2L），同时灭活PERV元件并插入7个人类基因，包括来自补体级联的CD46和CD55、来自凝血途径的THBD和PROCR、参与先天免疫的CD47，以及抑制缺血再灌注损伤、细胞凋亡和炎症的TNFAIP3和HMOX1（以下简称为3KO.7TG.RI）。对接受此供体肾脏的NHP受体进行的RNA-seq和IHC显示，所有人类转基因均得到表达，且在移植后176天尸检时肾移植物中维持表达，大量的基因编辑也并未损害肾功能，供体肾小球滤过率与匹配的未编辑猪之间没有差异。

尤卡坦小型猪（Yucatan miniature pigs）。图片来源：Nature

为了确认在3KO基础上额外表达7个人类基因的效用，研究者将3KO.7TG.RI、3KO和WT猪细胞分别于人或食蟹猴血清共孵育，观察到前者表现出显著更少的补体系统效应分子C3b的沉积，尽管共孵育45分钟时WT猪细胞被裂解，单独的3KO修饰几乎完全消除了人血清的补体依赖性细胞毒性，但当时间延长至15小时，3KO修饰的保护作用微乎其微，但3KO.7TG.RI依然能抵御血清的细胞毒性，证明转基因人CD46和CD55在猪KECs上表达时可调节补体活性。另外，作者还通过测定TNF处理后caspase3/7的激活情况证明转基因TNFAIP3和HMOX1的抗凋亡作用，以及THBD和PROCR在参与调节人类全血凝固方面的作用。

基因组编辑提供保护

研究者从猪体内分离出原代 KEC并进行体外分析。 正如预期的那样，通过流式细胞术分析（扩展数据图 4a、CD46、 CD55、EPCR 和血栓调节蛋白；扩展数据图 5a，CD47）和蛋白质印迹（扩展数据图 5c，TNFAIP3）分析发现基因编辑后，确实得到了保护。

当在人或食蟹猴血清中孵育时，3KO.7TG±RI KEC 表现出比 3KO 细胞显着更少的 C3b 沉积，表明转基因（或多个转基因）阻碍补体激活。 当与人或食蟹猴血清一起孵育45分钟时，WT细胞被裂解，而单独的3KO修饰几乎完全消除了人血清的补体依赖性细胞毒性，但食蟹猴血清则不然。 这表明食蟹猴血清比人血清具有更强的抗猪细胞毒活性。 当孵育时间延长至15小时时，3KO修饰不足以完全保护细胞，甚至免遭人血清导致的细胞死亡，而3KO.7TG±RI KECs可免受人和食蟹猴血清的细胞毒性，超出了所提供的保护范围 3KO（扩展数据图 4b）。 CD46和CD55转基因的贡献通过封闭抗体进行了验证。

此外，当CD46、CD55或两者在3KO KEC中表达时，每种都在功能上能够减轻补体激活（图3e）。 总的来说，这些数据表明转基因人 CD46 和 CD55 蛋白在猪 KEC 上表达时可调节补体活性。 通过包含这两种转基因，我们模仿了自然内置的冗余，这可能会使系统在炎症或组织损伤期间因脱落 (CD46)34 或酶裂解 (CD55)35 导致其中一个调节因子丢失的情况下更具弹性 。

工程猪肾成功支持生命

接下来，研究者将3KO±RI供体猪肾和3KO.7TG±RI供体猪肾分别移植到不同食蟹猴体内，这些食蟹猴接受双肾切除及免疫抑制处理。6名3KO±RI肾移植受体的生存期很短，仅在移植第6天就出现肾功能衰竭，第50天出现严重水肿和蛋白尿。相比之下，3KO.7TG±RI受体的存活时间明显更长，中位存活时间为176天，在功能上，单个移植肾对代谢物（例如肌酐）的过滤足以补偿原肾的缺失。对于异种移植存活时间最长的受体（758天），在移植后第502天活检显示肾脏组织学基本正常，伴有斑片状纤维化，且在肾小球中观察到C4d染色，表明C4激活，提示可能需要进一步改善免疫抑制方案。

这项工作证明源自3KO.7TG ± RI猪供体的肾移植物可支持食蟹猴生命长达758天，创造了新的记录。不过，虽然模型猪敲除的3种糖类抗原，但是，在研究中仍观察到有异种抗原激活受体的免疫反应，表明未来仍然需要进一步通过基因编辑，敲除掉更多的抗原，才有望保证移植的安全性。因此，具有免疫耐受特征的基因工程猪模型可能是未来研究目标。

值得一提的是，同一期Nature杂志配发了题为Pig-to-primate organ transplants require genetic modifications of donor的News & Views以及题为的Monkey survives for two years after gene-edited pig kidney transplant新闻，盛赞了该项突破性工作。

原始出处：

Anand, R.P., Layer, J.V., Heja, D. et al. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature 622, 393–401 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06594-4