导读

BRAF V600E突变发生在约10%的结直肠癌（CRC）中，驱动MAPK信号通路的持续激活。携带BRAFV600E突变CRC患者预后不良，对标准治疗反应较差，中位总生存期（OS）仅为BRAF野生型患者的一半。vemurafenib和dabrafenib等BRAF抑制剂对BRAFV600E突变黑色素瘤的有效率可达60%-80%，而BRAFi单药治疗BRAFV600E CRC的有效率仅为0-5%。既往研究指出，在BRAF被抑制后强大的自适应反馈网络可以迅速重新活化MAPK信号通路。因此基于BRAFi联合多种靶向MAPK反馈通路药物的临床研究被设计进行，以期提高BRAFV600E结直肠癌患者的应答率。

临床前研究表明，联合MAPK抑制和ICB可增强BRAF和KRAS突变型肿瘤的疗效，其潜在的协同作用机制包括BRAFi和/或MEKi对非肿瘤细胞（如抗原特异性及活化的CD8+ T细胞、记忆T细胞和克隆性T细胞）的直接作用可能引起肿瘤微环境的免疫启动。此外，在BRAFV600E黑色素瘤中联合BRAFi/MEKi和PD-1/PD-L1具有良好的疗效和持久的抗肿瘤反应。

基于以上结果，该团队就MAPKi和免疫检查点抑制剂联合用药进行了II期临床试验（NCT03668431），BRAFi达拉菲尼联合MEKi曲美替尼和PD1抗体sparatlizumab（PDR001）治疗37例（32例为MSS 型）BRAF V600E 转移性CRC。ITT人群ORR为24.3%，达到预设主要研究终点。其次，DCR为70.3%，mPFS 为4.3个月，mOS为13.6个月。引人注目的是，在28例MSS型未经过靶向或免疫治疗的患者中，ORR为25%，DCR %，mPFS 为5 个月。

转化研究观察到,由于自适应反馈机制，单独的BRAF或MEK抑制无法维持CRC中MAPK通路的抑制作用。BRAF/MAPK抑制和免疫应答之间有潜在的协同机制，有效抑制MAPK通路以肿瘤细胞固有的方式驱动免疫基因表达的诱导，而不依赖于肿瘤免疫微环境的刺激。通过更优化的MAPK通路靶向组合来改善MAPK抑制，可以促进更大的免疫协同性，并与ICB联合获得更好的临床疗效（Nat Med.2023 Feb; 29(2): 458-466. doi: 10.1038/ s41591-022-02181-8）。

研究背景

BRAFV600E突变发生在约10%的结直肠癌（CRC）中，从而驱动MAPK信号通路的持续激活。携带BRAFV600E突变CRC患者预后不良，对标准治疗反应较差，中位总生存期（OS）仅为BRAF野生型患者的一半。

BRAF抑制剂，包括vemurafenib和dabrafenib，对BRAFV600E突变黑色素瘤非常有效，有效率可达60%-80%，而BRAFi单药治疗BRAFV600E CRC的有效率仅为0-5%。

既往研究指出，在BRAF被抑制后，强大的自适应反馈网络可以迅速重新活化MAPK信号通路。因此基于BRAFi联合多种靶向MAPK反馈通路药物的临床研究被设计进行，以期提高BRAFV600E结直肠癌患者的应答率。值得一提的是，BRAFi+EGFRi，BRAFi+MEKi，以及BRAFi+EGFRi+MEKi 这三种联合策略已有临床数据支持。近期FDA批准了BRAFi Encorafenib和抗EGFR抗体cetuximab联合用于治疗BRAFV600E晚期结直肠癌，然而该方案的客观缓解率仅为20%，中位无进展生存期（PFS）仅为4.3个月。因此，迫切需要探索新的有效治疗方法。

免疫检查点抑制剂在约4% MSI-H/dMMR的转移性结直肠癌中应答率约为40%，而在转移性 MSS CRC中的响应率几乎为0%。约15-20%的BRAFV600E转移性结直肠癌为MSI，这类患者对BRAF/MAPK通路抑制剂的反应比MSS患者更好且更持久，这些数据提示BRAF通路抑制可能会增强BRAFV600E CRC的免疫应答。 

临床前研究表明，联合MAPK抑制和ICB可增强BRAF和KRAS突变型肿瘤的疗效，其潜在的协同作用机制包括BRAFi和/或MEKi对非肿瘤细胞（如抗原特异性及活化的CD8+ T细胞、记忆T细胞和克隆性T细胞）的直接作用可能引起肿瘤微环境的免疫启动。此外，在BRAFV600E黑色素瘤中，联合BRAFi/MEKi和PD-1/PD-L1具有良好的疗效和持久的抗肿瘤反应。

基于以上结果，该团队拟研究BRAFi/MEKi联合ICB在BRAFV600E CRC中的潜在协同作用。就MAPKi和免疫检查点抑制剂联合用药进行了II期临床试验，并对机制做了一定研究。

第一部分

MAPK inhibition enhances immune response in BRAFV600E CRC

作者分析了BRAFV600E CRC患者早期联合BRAF/EGFRi±MEKi临床研究中71例患者的RNAseq数据，包括45例配对活检（基线和治疗第15天）和26例基线活检。

基线 RNAseq显示，相比无应答者，应答者的T细胞明显增多（图1a）。

在所有患者中，治疗15天后，相对于基线水平，T细胞、细胞毒性T细胞和其他免疫特征均有所增加，表明BRAF通路抑制后肿瘤中T细胞和免疫浸润增加（图1b） 。

为了模拟这种潜在的协同作用，作者用C57BL/6结肠类器官，敲除APC、TP53和SMAD4，并表达BRAFV600E（ABPS细胞），构建了同源BRAFV600E CRC小鼠肿瘤模型。

小鼠移植瘤实验显示，联合使用BRAFi/MEKi/PD-1抑制剂可以更显著、更持续地减少肿瘤生长（图1c）。

在治疗10天后的肿瘤中，BRAF/MEKi处理导致CD3+CD8+ T细胞的百分比显著增加（图1d, e），单独使用PD-1抗体并没有导致CD3+CD8+ T细胞明显增加，但联合使用BRAFi/MEKi/PD-1抗体进一步使CD3+CD8+ T细胞显著增加（图1d, e）。

第二部分

Clinical efficacy

基于前期数据，作者启动了首个临床试验，探究BRAFi dabrafenib、MEKi trametinib和抗pd-1抗体spartalizumab（PDR001）治疗BRAFV600E CRC患者的疗效及安全性（概念验证II期单臂临床试验）。

计划入组40例BRAFV600E CRC患者，至数据截止，已入组37例。5例患者既往接受过BRAFi和/或免疫检查点抑制剂治疗。中位随访时间为995天（245-1324）。主要研究终点 ORR，次要终点PFS、DCR、DOR和OS。

在37例患者中，9例获得了确定的缓解, 其中2例患者达到CR（ORR: 24.3%; 95%CI: 11.9-41.2%），另有1例患者获得未证实的缓解，DCR为70.3%（95% CI: 53-84.1%)（图2a），与BRAFV600E CRC中单独使用达拉非尼加曲美替尼的历史数据相比，有显著提高（ cORR: 7% ）。

中位治疗持续时间为7.4个月（95% CI: 4.2-7.9个月）（图2b）。

在32例既往未接受BRAFi或ICB治疗的患者中，cORR为28.1%，DCR为71.9%（图2c）。

在MSS BRAFV600E CRC患者中，cORR为25%（95% CI: 10.7-44.9%），DCR为75%（95% CI 55.1-89.3%）（图2d），再次优于历史对照。

中位PFS为4.3个月（95% CI 3.7-7.3个月），中位OS为13.6个月（95% CI 8.2-16.5个月）。

在MSS BRAFV600E 既往未接受过BRAFi或ICB治疗的CRC患者中，中位PFS为5个月（95% CI 3.7-7.4个月），5名患者（18%）持续接受治疗超过一年，1名患者获得了持续2.5年的PR。既往研究中单独使用DT的中位PFS仅为3.5个月，没有MSS患者持续治疗超过1年

左半和右半原发肿瘤没有观察到疗效的显著差异。

既往接受过BRAFi或ICB治疗的CRC患者的ORR为20%，PFS为3.7个月，OS为8.2个月。

基线活检分析显示，之前被报道影响预后和治疗反应的因素，如TMB、BM1/BM2转录亚型和CMS分型，均与临床结果不相关。

BRAF转录亚型可以分为2类：BM1和BM2。BM1亚型与KRAS/AKT通路激活有关,因此对BRAF与MEK抑制剂敏感。BM2亚型细胞周期检查点下调,因此对CDK1抑制剂敏感。

第三部分

Tumor-intrinsic immune response and MAPK inhibition

为了探究BRAF/MAPK通路抑制与肿瘤免疫反应的潜在相互作用，所有患者都进行了基线和治疗后第15天同一肿瘤的配对活检。用scRNAseq对23例患者的新鲜肿瘤组织进行分析，共有419,551个单细胞通过了质量控制（QC），这些细胞包括肿瘤、间质、免疫细胞和肿瘤上皮细胞群（图3a）。

比较治疗前和治疗后单个细胞群丰度的变化，可观察到PFS > 6个月的患者（n=11）治疗后肿瘤上皮细胞显著减少，CD45+免疫细胞、T细胞和CD8+ T细胞显著增加，而PFS < 6个月的患者（n=12）治疗后细胞群无明显改变（图3b）。

对比治疗前后差异表达基因，发现PFS > 6个月患者中免疫相关基因的表达显著增加，而PFS < 6个月患者中未观察到。这些基因包括参与干扰素(IFN)反应的基因（如STAT1, IRF1, IFITM1, IFITM3, BST2和TRIM31），抗原加工和递呈基因（如B2M, CD74, PSMB10, TAP1, HLA-A, HLA-C, HLA-F，HLA-DRB1和HLA-DPA1），趋化因子（例如CXCL9、CXCL10和CXCL11）（图3c,d），提示IFN刺激的转录程序和抗原加工和递呈途径的全面上调。

研究者进一步评估了人类结直肠癌恶性上皮特异性ISG程序的评分，该程序最近在一个独立的scRNAseq研究中获得，与I型干扰素反应和趋化因子活动相关，表征激活的T细胞。

PFS > 6个月的患者在治疗后第15天的评分（pEpiTd19 ISG）显著增加，而PFS < 6个月的患者则没有变化。

接下来利用MAPK基因表达签名分数检测了肿瘤上皮细胞中MAPK调节转录本（DUSP6, ETV4, ETV5和SPRY4）的变化，观察治疗前后肿瘤细胞中MAPK通路抑制情况。结果显示在PFS > 6个月患者的肿瘤上皮细胞中，MAPK评分在治疗后显著降低，而在PFS < 6个月的患者中则无明显变化（图3h）。

上述结果提示肿瘤固有免疫程序的诱导及MAPK通路的抑制与更长的PFS相关。

第四部分

Enhanced immune response driven by optimized MAPK inhibition

基于以上结果，假设在肿瘤细胞中MAPK抑制程度可能与肿瘤内在诱导免疫基因表达的程度直接相关。接下来分析了来自先前BRAF/MEK/EGFR抑制临床试验中BRAFV600E结直肠癌患者的45对基线和治疗后第15天活检组织的RNAseq数据。

结果显示，在治疗后第15天，免疫特征的诱导与MAPK通路抑制的程度相关（扩展数据图6a），这些信号包括T细胞和细胞毒信号、免疫检查点信号和吞噬相关信号（扩展数据图6b）。

此外，治疗前后MAPK抑制程度与免疫特征诱导之间存在相关性，包括T细胞、免疫检查点和先天免疫反应通路（扩展数据图6c）。在MAPK通路抑制程度较高的BRAFV600E CRC患者中观察到更强的免疫特征增加，表明肿瘤细胞中MAPK抑制程度可能驱动免疫基因诱导和肿瘤的免疫应答。

为了评估肿瘤细胞内MAPK抑制与免疫程序诱导之间的潜在关系，作者利用10例患者的基线肿瘤活检组织成功建立患者来源的类器官模型，其中5例PFS > 6个月，5例PFS < 6个月。

用DT处理类器官，qPCR检测基因表达。结果显示，与来自PFS < 6个月患者的类器官相比，PFS > 6个月患者的类器官在IFN反应相关基因（IFIT1, IFIT2, IFIT3和IRF1）的表达和趋化因子（CXCL9, CXCL10和CXCL11）活性方面有显著上调（图4a，左）。而PFS < 6个月患者的类器官在DT治疗后显示出较低程度的MAPK通路抑制（通过平均DUSP6, ETV4, ETV5和SPRY4 log2FC计算）（图4a，左）。提示MAPK通路抑制不足可能是免疫上调差异的潜在原因。

对类器官的转录组学分析（ RNAseq）显示，与来自PFS < 6个月患者的类器官相比，来自PFS > 6个月患者的类器官显著诱导了更多的免疫基因集（图4b）。

这些数据证实，MAPK通路抑制以肿瘤细胞固有的方式驱动免疫基因表达的诱导，而不依赖于肿瘤免疫微环境的刺激，因为类器官培养物只含有肿瘤细胞，不包含来自肿瘤微环境的免疫细胞或基质细胞。

为了探究BRAF/MAPK通路的更强抑制是否可以增强所有肿瘤模型（包括PFS < 6个月的患者）的免疫基因诱导程度，作者进一步使用了BRAFi+ERKi的组合。

当用DE治疗时，所有类器官都表现出强大的MAPK抑制作用，无论来自类器官的患者的临床结局如何（图4a，右）。BRAF/ERK抑制在所有类器官中显著诱导了免疫应答基因的表达（图4a，右），这表明通过更完全的MAPK抑制可以实现更高的ISG诱导，特别是在对BRAF/MEKi反应较差的类器官中。

与BRAF/MEKi治疗相比，BRAF/ERK抑制剂（ERKi）处理普遍诱导PFS > 6个月和PFS < 6个月患者来源的类器官中免疫相关基因的强烈富集（图4b）。

在所有类器官中，BRAF/ERKi诱导的ISG上调和MAPK抑制程度明显高于BRAF/MEKi（图4c）。 

与PFS < 6个月的患者相比，BRAF/MEKi导致PFS > 6个月患者来源类器官的ISG评分显著增加，而BRAF/ERKi导致两组类器官的ISG评分诱导程度相当，无显著差异。两组患者在BRAF/ ERKi处理后的ISG评分诱导水平均等于或大于PFS > 6个月患者经BRAF/MEKi处理后的诱导程度（图4d）。

ISG评分与MAPK评分呈显著负相关（图4e）。

综上所述，这些结果表明：（1）单独有效抑制MAPK可诱导肿瘤细胞固有免疫基因表达；（2）提高MAPK抑制程度可使所有患者模型中肿瘤固有免疫基因表达水平达到与BRAF/MEKi处理后PFS > 6个月患者相同的水平。

第五部分

Toxicity AE summary

总体而言，该方案耐受性良好；3级以上毒副反应发生率较低；

皮疹、发烧、腹泻、疲乏、转氨酶升高是最常见的不良事件。

结论及研究意义

由于自适应反馈机制，单独的BRAF或MEK抑制无法维持CRC中MAPK通路的抑制作用；

BRAF/MAPK抑制和免疫应答之间有潜在的协同机制，有效抑制MAPK通路以肿瘤细胞固有的方式驱动免疫基因表达的诱导，而不依赖于肿瘤免疫微环境的刺激；

通过更优化的MAPK通路靶向组合来改善MAPK抑制，可以促进更大的免疫协同性，并与ICB联合获得更好的临床疗效。