脑出血手术后的术后再出血与高死亡率密切相关，但目前尚无有效的临床治疗方法。在本研究中，郑州大学史进进/刘军杰/张开翔/张振中开发了一种血红蛋白（Hb）响应性的原位植入式DNA水凝胶，该水凝胶包含与两条互补链交联的Hb适体，并封装了甲磺酸去铁胺（DFO）。功能性地，该水凝胶在术后再出血时通过捕获Hb产生信号，展现出独特的“自我诊断”能力。此外，持续捕获Hb会介导水凝胶的逐渐解体，从而实现DFO的按需释放，而不会影响生理铁依赖功能。这一过程通过抑制神经细胞的铁死亡来实现自我治疗。在胶原酶和自体血液注射模型诱导的模拟术后再出血模型中，该水凝胶展示了铁吸收效率的5.58倍提升，显著减少了血肿大小（从8.674立方毫米减少到4.768立方毫米）。这种创新的Hb响应性DNA水凝胶不仅为术后再出血提供了治疗干预，而且还提供了自我诊断反馈，为提高临床治疗效果带来了显著的希望。该研究以题为“In situ implantable DNA hydrogel for diagnosis and therapy of postoperative rehemorrhage following intracerebral hemorrhage surgery”的论文发表在《Science Advances》上。

图1展示了所开发的血红蛋白（Hb）响应性原位植入式DNA水凝胶的构建和特性。这种水凝胶由Hb适体与两条互补链交联而成，并封装了甲磺酸去铁胺（DFO）。其设计原理是，在术后再出血的情况下，水凝胶能够通过捕获Hb发出信号，实现自我诊断。同时，Hb的持续捕获会触发水凝胶的逐步解体，从而按需释放DFO，这一过程不会干扰铁依赖性的生理功能，并通过抑制神经细胞的铁死亡达到自我治疗的目的。

图1.原位植入式DNA水凝胶用于脑出血术后再出血的诊断与治疗

【DNA水凝胶的合成】

首先，通过分散锚定DNA链于丙烯酰胺溶液中，经过聚合反应制备出带有多个DNA链的丙烯酰胺聚合物。然后利用沃森-克里克碱基配对原理，使用能够与锚定DNA互补互作的DNA交联剂将丙烯酰胺聚合物连接起来，成功合成了DNA水凝胶。为了提高水凝胶对ICH（脑出血）病灶特有毒性蛋白Hb的识别能力，研究者采用了Hb适体作为交联剂，连接两条DNA链。在Hb存在的情况下，适体与目标竞争形成复合物，导致交联的适体-DNA双链解体，从而释放水凝胶中的药物。此外，通过设计不同的互补寡核苷酸并利用磁珠实验筛选出对Hb响应最敏感的B-7设计。进一步的实验验证了DNA链组合对Hb的响应性，通过荧光共振能量转移（FRET）原理，当Hb与其特异性适体结合时，荧光基团的荧光被恢复，表明双链DNA的解杂交被触发。这些结果表明，所设计的DNA水凝胶能够有效地响应Hb，为后续的智能药物释放提供了基础。

图2.DNA水凝胶的合成

【DNA水凝胶的特性】

图3通过不同浓度的Hb适体链交联剂制备了几种水凝胶，并通过流变学测试确定了0.7 mM浓度的水凝胶具有最适合脑环境的储能模量（206 ± 5 Pa），类似于脑组织的模量（200 ± 14 Pa）。此外，该水凝胶在不同振荡条件下显示出稳定的结构，其储能模量始终高于损耗模量。水凝胶的膨胀性能对于作为脑植入物也至关重要，0.7 mM浓度的水凝胶展现出适度的膨胀比（128.1 ± 6.9%），有助于减轻由血肿、水肿或植入物引起的质量效应。体外降解实验表明，0.7 mM的水凝胶在Hb溶液中7天后的降解率为13.09%，表明水凝胶能够响应ICH微环境以实现控制药物释放。药物释放行为的研究进一步证实了水凝胶在Hb浓度增加时按需释放DFO的能力。最后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）确认了药物在Cy5标记的水凝胶中的封装情况。综合这些结果，0.7 mM浓度的水凝胶被选为优化的水凝胶，用于后续实验，因其展现出了优异的注射性、适应性以及药物封装和按需释放的能力。

图3. DNA水凝胶的特性

【体外Hb响应性药物按需释放的DNA水凝胶】

图4通过扫描电子显微镜（SEM）图像确认了Hb处理后水凝胶形成了微孔通道并增大了孔径。流变学研究显示Hb处理后的水凝胶储能模量降低，表明了水凝胶从凝胶态到溶胶态的转变。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结果显示Hb处理后药物浓度显著降低，证实了药物的释放。通过紫外/可见（UV-vis）光谱法检测了水凝胶与Hb溶液共孵育后上清液中的Hb含量，以此获得溶胶比例。设计了突变型链作为对照组，以证明观察到的凝胶-溶胶转变是由Hb/适体相互作用引起的。此外，为了展示智能DNA水凝胶系统的专一性，使用了牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照，结果表明智能水凝胶保持了对目标Hb的高特异性响应。最后，研究了DNA水凝胶对Hb的敏感性，随着Hb浓度的增加，水凝胶的颜色变化和溶胶百分比逐渐增加，表明水凝胶能够根据Hb浓度的变化调节药物的释放。

图4.体外Hb响应性药物按需释放的DNA水凝胶

【体外通过对抗铁死亡和Hb毒性的DNA水凝胶的保护效果】

实验首先评估了水凝胶对各种脑细胞的潜在毒性，结果显示不同浓度的水凝胶对HT-22细胞没有明显的细胞毒性，证实了水凝胶的生物相容性。随后，通过FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe(II)的浓度，发现水凝胶处理组的荧光强度显著降低，表明水凝胶能有效缓解铁过载。通过流式细胞术分析，同样证实了水凝胶能够降低细胞内铁离子浓度。此外，水凝胶能够逆转由FAC诱导的铁死亡导致的GPX4蛋白表达下调，并通过DCFH-DA检测显著降低细胞内活性氧（ROS）水平，减少脂质过氧化产物MDA的积累，降低4-HNE水平，从而抑制铁死亡。最后，通过CCK-8实验检测细胞活性，结果表明水凝胶显著提高了细胞存活率，证实了水凝胶通过控制DFO的释放有效减少了由FAC引起的细胞损伤。这些结果表明，DNA水凝胶通过捕获Hb减少神经细胞死亡，并释放DFO缓解铁死亡，展现出优秀的神经保护效果。

图5. 体外通过对抗铁死亡和Hb毒性的DNA水凝胶的保护效果

【体内水凝胶的稳定性、特异性和生物安全性】

图6通过将Cy5标记的水凝胶植入健康小鼠体内，研究者观察了水凝胶在正常生理条件下的留存时间，发现这些植入物至少能稳定存在6天。进一步地，在脑出血病理环境中注射了水凝胶和对照组无响应水凝胶，结果显示响应性水凝胶在第二天开始逐渐解体，并在第六天几乎完全降解，而无响应水凝胶的荧光强度仍然很高，这表明水凝胶能够响应出血微环境。此外，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量了小鼠外周血液中的白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度，两组之间没有明显差异，表明水凝胶没有引起显著的免疫反应。小鼠的体重变化和行为观察也显示水凝胶长期植入对小鼠没有明显的不良影响。最后，通过H&E染色和末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶三磷酸末端标记（TUNEL）染色确认了水凝胶在脑组织中没有引起损伤，进一步证实了其生物安全性。

图6. 体内水凝胶的稳定性、特异性和生物安全性

【体内水凝胶治疗效果】

图7通过建立小鼠脑出血模型，研究人员评估了水凝胶对铁离子清除效率的影响，并通过普鲁士蓝染色和GPX4免疫荧光染色观察了治疗效果。结果显示，与DFO（去铁敏）处理组相比，水凝胶组脑组织中的铁离子沉积显著减少，GPX4表达降低得到有效抑制，这表明水凝胶能提高铁清除效率并保护细胞免受铁死亡的影响。此外，水凝胶处理的小鼠在体重变化、MDA（丙二醛）和ROS（活性氧）水平检测中，均显示出比对照组更好的结果，说明水凝胶有助于减轻氧化应激和脂质过氧化。更重要的是，通过T2*加权磁共振成像（MRI）和脑切片分析，水凝胶处理组的小鼠血肿体积显著小于对照组，证实了水凝胶在促进血肿吸收方面的显著效果。最后，通过Nissl染色和NeuN（神经元核抗原）染色评估了水凝胶对脑组织的保护作用，结果显示水凝胶处理组的小鼠脑组织损伤更小，神经元数量更多。综上所述，DNA水凝胶在体内对脑出血治疗具有显著的疗效，能有效促进血肿吸收，减少氧化损伤，并保护神经元，为脑出血治疗提供了一种潜在的新疗法。

图7. 体内水凝胶治疗效果

【体内脑出血小鼠模型的术后康复】

图8设计了一系列的康复训练和测试，包括神经功能评分、梁平衡测试、角落测试、粘附移除测试等，用以评估小鼠术后的康复情况。通过这些测试，研究人员能够客观地测量小鼠的认知和运动功能，从而评估治疗效果。实验结果表明，接受水凝胶治疗的小鼠在各项测试中表现更佳，能够更稳定地行走直线，神经功能缺损评分更低，表明损伤较轻。此外，梁平衡测试、角落测试、悬空身体摆动测试和粘附移除测试也反映出接受水凝胶治疗的小鼠在术后康复方面有显著优势。

图8. 体内脑出血小鼠模型的术后康复

【术后再出血的自我诊断和自我治疗DNA水凝胶】

图9利用Cy3标记的Hb适体和BHQ2标记的链B构建了一个能够在再出血时发出荧光信号的水凝胶。在形成三链复合体后，Cy3的荧光被邻近的荧光猝灭剂BHQ2猝灭，当再出血发生，Hb存在时，Cy3的荧光恢复，表明水凝胶能够感知再出血。通过在胶原酶诱导的ICH模型和自体血液注射模型中测试，水凝胶显示出对不同再出血体积的敏感性，荧光恢复随着再出血体积的增加而增强。此外，T2加权MRI扫描结果与荧光成像结果一致，证实了水凝胶对再出血体积变化的检测能力。在再出血后的治疗研究中，水凝胶显著降低了小鼠脑内MDA含量和Hb浓度，减少了血肿体积，并通过H&E染色显示了对脑组织的保护效果。

图9. 术后再出血的自我诊断和自我治疗DNA水凝胶

【小结】

该研究开发了一种创新的血红蛋白（Hb）响应性原位植入式DNA水凝胶，用于治疗脑出血手术后的再出血问题。这种水凝胶能够通过捕获Hb来自我诊断术后再出血的发生，并通过逐步解体来按需释放封装在其中的甲磺酸去铁胺（DFO），以此抑制神经细胞的铁死亡，实现自我治疗。在模拟术后再出血的动物模型中，该水凝胶显著提高了铁吸收效率，并减少了血肿的体积。这项研究不仅提供了一种有效的治疗手段，而且通过自我诊断功能为临床治疗提供了即时反馈，展现出改善临床结果的潜力。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado3919