导读:

脂质稳态失调与最常见的痴呆形式阿尔茨海默病(AD)有关。在识别AD的PCT扫描和脑脊液生物标志物方面取得了实质性进展，但它们作为一线诊断工具的用途有限。细胞外小泡(EVs)由所有细胞释放，包含其亲代细胞组成的子集，包括脂质。EVs从大脑释放到外周，提供了组织和疾病特异性脂质生物标志物的潜在来源。然而，中枢神经系统的EV脂质目前未知、脑源性细胞外小泡(BDEVs)导致的AD脂质稳态失调仍不清楚。近期墨尔本大学团队在《Journal of Extracellular Vesicles》(IF=14.976)发表了题为“Characterization of brain-derived extracellular vesicle lipids in Alzheimer's disease”的论文，该文章揭示人额叶皮质脑源性细胞外小泡（BDEVs）的脂质组成，并确定BDEVs在AD中是否具有改变的脂质分布，使用半定量质谱技术描述BDEV脂类，报道了BDEVs有富含包含乙醚的甘油磷酸脂。这一发现进一步证实了醚脂质是EV的一个特征，本研究强调了EVs相对于更复杂组织的优势，以改善对可能作为外周潜在生物标志物的失调脂质的检测。

01BDEVs特性

作者最近报道了一种从死后人类额叶皮层中分离小细胞外囊泡的方法，该方法包含内体衍生外泌体的特征。这些囊泡符合国际细胞外囊泡学会 2018 年指南规定的实验要求。在这里，作者采用这种方法从AD和CTL受试者获得的死后额叶皮层脑组织中分离BDEV。解离的胶原酶处理的组织进行顺序离心，并将 10,000 x g 上清液加载到三重蔗糖密度部分的顶部，以根据密度分离EV（补充图 1）。死后延迟和储存等因素会对组织质量产生负面影响，导致EV颗粒被细胞碎片污染。作者此前曾报道，免疫印迹为组织EV分离提供了最强大的质量控制措施，钙连接蛋白等蛋白质提供了一个有用的EV纯度指标。因此，在对样本进行下游脂质组学分析之前，作为当前研究的一部分分离的所有溴化二苯醚都要接受蛋白质印迹和透射电镜(图中1A和1B的代表性图像)的检测。根据之前的研究，在密度约为1.08克/立方厘米的馏分2 (F2)中发现了小型EV。EV特异性小标记物TSG101和联蛋白中的血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素转换酶抑制剂，以及钙结合蛋白的耗竭(图1A)。F2的透射电镜图像显示，对于AD和CTL样品，小的杯状膜泡直径为40–200纳米(图1B)。综上所述，这些结果表明F2包含的囊泡与我们之前报道的内体衍生的小BDEVs的密度、形态、大小和蛋白质共富集一致。补充表2显示了为每个组织和BDEV部分测定的蛋白质含量，其中平均而言，与CTL受试者相比，AD受试者产生了大约一半的BDEV产量，这可能反映了疾病晚期发生的细胞功能障碍。

补充图1 人类死后额叶皮层 BDEV 分离和分析的实验工作流程总结

图1 人额叶皮质BDEVs的特征

02额叶皮质和衍生BDEVs的脂质分析

为了研究额叶皮质组织的脂质组成和从该组织中分离的BDEVs，进行了深入的半定量质谱分析。共鉴定了来自四个主要脂质类别的692个脂质分子，包括甘油磷脂(GP)、鞘脂(SP)、甘油脂(GL)和甾醇脂质(ST)，涵盖17个脂质类别，并在“总和组成”水平进行了半定量(即脂质类别、亚类的身份以及脂肪酰基/烷基/烯基部分中碳原子总数和C=C双键总数的分配。例如，PE(P-38:4)表示1-(1Z-链烯基)，2-酰基甘油磷酸乙醇胺脂质，在链烯基和酰基链中总共含有38个碳和四个双键)。初始脂质分析表明，胶原酶不会导致脑组织中鉴定脂质的数量或丰度发生任何显著变化(数据未显示)。在补充表3中总结了在脂质类别、类别或亚类水平上鉴定的脂质种类的数量，以及它们的平均总脂质丰度，或者标准化为组织重量(即，pmol/mg组织)、蛋白质含量(即，pmol/μg蛋白质)、总鉴定脂质浓度(即，总脂质摩尔百分比)、总鉴定脂质种类浓度(即，摩尔百分比类别)，或者总鉴定脂质类别浓度(即，摩尔百分比类别)。在补充表4中可以找到一份完整的单个鉴定脂质及其在组织和BDEVs中的丰度列表。

疾病和CTL额叶皮层之间在总脂质水平、脂质类别或注释的类别水平上没有观察到差异（补充表3和补充图2）。然后作者确定了BDEVs从这个额叶皮层组织中分离出来并与组织轮廓进行比较。图2A和补充图 3A 显示分别为 CTL 和 AD 受试者脂质类别总脂质丰度的平均值。BDEV的共同特征，独立于诊断，包括显着更高的GP（P < 0.0001，mol%）和更低的SP（P <0.0001，mol% ) 与亲本组织相比。在脂质类水平上，BDEV 显着富集 PS（P<0.0001，mol%），神经节苷脂脂质相应减少（P<0.0001，mol%）（图2B 和补充图 3B）。令人鼓舞的是，BDEV 在 GL 或胆固醇酯 (CE) 脂质中并不丰富（图2 和补充图 3），表明脂蛋白污染有限。位于线粒体内膜上的心磷脂（CL）的丰度也有限（图2B、补充图3B），进一步验证了作者从组织中分离EV的方法。

图2 对照受试者额叶皮质和该组织中BDEVs总脂质丰度的比较

补充图3 比较来自阿尔茨海默病受试者的该组织中额叶皮层和 BDEV 之间的总脂质丰度差异

由于BDEVs中GP和SP水平的显著差异，作者研究了这些类别中最丰富的脂质类别和亚类的组成(图3)。对于GP类别，这包括PC、PE和PS脂质亚类(即二酰基、烷基醚(O)、缩醛磷脂 (P)、溶血酰基(L)、溶血醚(L-O)和溶血缩醛磷脂(L-P))(图3和补充4A-C)以及处于“总和组成”注释水平的PS脂质(图3D和补充4D)。在注释的GP亚类水平上，BDEVs的共同特征是明显的，包括相对于组织，二酰基-PC、二酰基-PE、PS-O和PS-P脂质的摩尔%显著增加，以及相应的PC-O、酰基-LPE、二酰基-PS和LPS-O物种的摩尔%减少(图3A-Cand补充物4A-C)。对于PS脂质，在注释的摩尔%“总和-组成”水平，BDEVs显示出广泛的重塑，该结果表明BDEV组合物发生了显著的重塑，引入了更多的含烷基和烯基的缩醛磷脂物质，而不是更典型的含二酰基的物质。

图3 组织和BDEVs中PC、PE和PS脂质亚类丰度和单个PS脂质分子的比较

额叶皮质包含来自多个细胞部位(例如质膜、细胞器和髓鞘)的复杂脂质混合物。通过从该组织中富集内皮祖细胞，作者旨在降低脂质谱的复杂性和信噪比，从而能够检测出AD中的变化，否则通过对大体组织进行谱分析会遗漏这些变化。在类别水平上比较CTL和AD BDEV(图4A)。相对于CTL BDEVs，AD BDEVs中的SP相应增加(P < 0.001)(摩尔%，图4A和pmol/μg蛋白质，补充表3)。

在子类水平上进行比较显示，相对于 CTL BDEV，AD BDEV 中的 PE-P（摩尔％）增加了大约两倍，同时二酰基 PE 显着下降（图 4B）。在 PE mol%“总组成”水平上，在 AD BDEV 中观察到显着的酰基链重构，从而能够与 CTL 样品区分开来。其中包括增加的 LPE(18:1)、PE(P-36:2) 和 PE(P-38:4)，以及减少的 LPE(22:6)、LPE(22:4)、PE(38:4)和 PE(40:6)（图 4C）。虽然在 PC 和 PS 亚类中 CTL 与 AD BDEV 之间没有观察到差异（补充图 5A 和 5C），但 PC（34:1）、LPS（O-18:2）和 PS（26:1）显着增加，相应减少在 AD 与 CTL BDEV 中观察到 PC(34:0)、PC(36:1)、PC(38:4) 和 PS(40:6) 物种（补充图 5B 和 5D）。检测到的 PE 脂质亚类和“总组成”水平也基于绝对值（即 pmol/μg 蛋白质丰度）和基于脂质组范围的标准化，即mol% 总脂质（补充图 7）。所有归一化方法都显示出类似的结果。AD BDEVs 包含的 LPE(22:6)、PE (38:4)、PE(40:6) 和 PE(40:4) 数量至少是 CTL BDEVs 的一半（pmol/ug 蛋白质，P < 0.0001） （补充图 6）。

在含有二十二碳六烯酸(C22:6 ω3)的AD BDEVs中观察到的脂质种类显著减少，如LPE(22:6)、PE(40:6)和PS(40:6)、二十二碳四烯酸(C22:4 ω6)如LPE(22:4)和花生四烯酸(C20:4 ω6)，如PC(38:4)和PE(38:4)(均由HCD-质谱/质谱证实)(图4C和补充图6和7）。

图4 BDEV对照与阿尔茨海默病组织总脂质丰度的比较

比较 AD BDEV 中单个 SM 和 Cer 脂质种类的 mol% 丰度（图 5A 和 5B，分别为）揭示了 SM(d36:1)、SM(d38:1) 和 Cer(d36:1) 物种的显着减少，以及非常长的包含 SM(d42:2) 的链（主要是 SM (d18:1/24:1)）。这被含有相同酰基链组成的硫苷脂脂质硫苷脂 (d42:2) 的 mol% 丰度显着降低所抵消（补充图8C），表明 AD BDEV 中鞘脂代谢的半乳糖神经酰胺途径中发生了额外的重塑。

图5 来自对照和阿尔茨海默病组织的BDEV SM和Cer单个脂质分子的比较

综上所述，这些发现表明，阿尔茨海默病脑源性神经营养因子具有独特的脂质特征，将它们与小脑延髓额叶皮质的脑源性神经营养因子区分开来，并强调了分析总组织的脑源性神经营养因子对于发现脂质谱中与疾病相关的变化的用途。

小 结

作者使用优化的方法富集脑源性细胞外小泡，结合氘化内标和直接注入纳米电喷雾电离(nESI)以及超高分辨率和精确质谱(UHRAMS)分析；该研究首次对来自中枢神经系统组织的溴化二苯醚的脂质成分进行了半定量表征。作者的研究表明，未来的研究应评估外周来源的脑源性痴呆患者的醚PE脂质和含多不饱和脂肪酰基的脂质以及其他临床指标，以确定外周的脑源性痴呆患者是否可以预测从轻度认知障碍(MCI)到阿尔茨海默病的进展。